Реактивы и оборудование

80%-ный ацетон; СаСО₃, МgСО₃ или 1 н раствор NН₄ОН; фарфоровые ступки и пестики, мерные пробирки на 10 мл., аналитические весы, центрифуга, спектрофотометр, штатив для пробирок

Ход работы: навески свежего растительного материала (30 мг) в трех повторностях как для растений, выращиваемых на дистиллированной воде, так и для образцов из среды, содержащей металл тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством 80%-ного ацетона (1мл), чистого кварцевого песка и мела (или углекислого магния, или 1н раствора гидроксида аммония). Гомогенат переносят в предварительно пронумерованные центрифужные пробирки, обмывая ступку и пестик 2 мл ацетона и центрифугируют при 6-7 тысячах оборотов в течение 7 мин. Экстракт осторожно сливают в мерную пробирку на 10 мл. К осадку в центрифужной пробирке добавляют свежий 80%-ный ацетон, перемешивают раствор стеклянной палочкой и центрифугируют повторно. Надосадочную жидкость аккуратно сливают в соответствующую мерную пробирку с экстрактом, полученным после первого фильтрования и доводят объем вытяжки чистым растворителем до 7 мл. Полученная ацетоновая вытяжка содержит сумму зеленых и желтых пигментов.

Концентрация пигментов в вытяжке может быть определена на фотоэлектроколориметре по калибровочной кривой или непосредственно на спектрофотометре (СФ-26, СФ-46 и т.д.) с использованием для расчета концентрации пигментов соответствующих формул (Вернера, Арнона и др.).

Для количественного определения часть полученного экстракта наливают в кюветку спектрофотометра. Вторая кювета заполняется чистым растворителем (80%-ным ацетоном). Кюветы помещают в кюветную камеру спектрофотометра и определяют оптическую плотность (D) при длинах волн, соответствующих максимумам определяемых пигментов.

Концентрация отдельных пигментов (хлорофиллов А и В) определяется двухволновым методом в общей смеси пигментов и сводится, таким образом, к следующему: с помощью спектрофотометра устанавливается величина оптической плотности (D) суммарной вытяжки пигментов при двух длинах волн, соответствующих максимумам поглощения пигментов в данном растворителе (в ацетоне - 665, 649).

Содержание суммы каротиноидов определяют в этой же вытяжке, измеряя величину оптической плотности (D) при длине волны 440,4 нм

Задание: занесите показания спектрофотометра в таблицу 4 и рассчитайте концентрацию пигментов в исследуемом растении.

Таблица 4

Образец	D440,5	D649	D665

 

Концентрация пигментов рассчитывается по формуле Вернера.

С_А(мг/л)=11,63*D665 – 2.39*D649;

С_В(мг/л)=20,11*D649 – 5.18*D665;

С_А+С_В(мг/л)=6,45*D665+ 17.72*D649

Содержание суммы каротиноидов рассчитывается по формуле Веттштейна:

Скар(мг/л)= 4,695*D440,5 – 0,268(Са+б мг/л)

Установив концентрацию пигмента в вытяжке, определяют его содержание в исследуемом материале с учетом объема вытяжки и массы пробы:

A = C·V / P·1000,

где C- концентрация пигментов в мг/л,

V- объем вытяжки пигментов в мл;

А- содержание пигмента в растительном материале в мг/г свежего веса;

Р- навеска растительного материала в г.

Количество пигментов выражают в миллиграммах на единицу сырого или сухого веса, в % от сухого (сырого) веса, в миллиграммах на единицу площади листа (например, на дм²).

Обычно в нормальных зеленых листьях содержание хлорофилла колеблется от 0,5 до 3 мг на 1 г свежего веса при отношении А/В =2,5-3. Содержание каротиноидов – 0,1-0,5 мг/г свежего веса.

Задание: сравните количества хлорофилла, полученное в опыте 6 и 7. Объясните полученные данные.