Выключение генов

Навчальні задачі.

 

Актуальность проблемы

Отличительной особенностью эукариотического генома является большое количество различных типов диспергированных и тандемно организованных повторяющихся последовательностей ДНК. Многие из этих повторов являются источниками различных полиморфизмов и используются в качестве генетических маркеров в популяционных и эволюционных исследованиях (Рысков, 1999). Функциональная роль большинства повторов остается неясной, хотя и предполагается, что некоторые из них могут играть важную роль в регуляции генной экспрессии, например, путем участия в специфической организации хроматина (Трифонов, 2002).

Организмы адаптируются к меняющимся условиям окружающей среды путём изменения экспрессии (скорости транскрипции) генов. Этот процесс, в деталях изученный на бактериях и вирусах, включает взаимодействие специфических белков с участками ДНК в непосредственной близости от стартового участка транскрипции. При этом может происходить включение или выключение транскрипции. Эукариотические клетки используют тот же самый принцип, хотя в регуляции реализуются и некоторые другие более сложные механизмы. (http://biochemistry.ru/biohimija_severina/B5873Part31-185.html)

Экспрессия генов

При репрессии трансляции, на некоторых этапах развития живых организмов, особенно на стадии морфогенеза и поддержания клеток в недифференцированном состоянии (например, в случае стволовых клеток), важное значение имеют эндогенно экспрессируемые микроРНК, которые являются продуктами интронных и межгенных участков. Роль таких эндогенно экспрессируемых микроРНК в подавлении экспрессии генов была впервые описана у нематоды Caenorhabditis elegans в 1993 году. У растений такая функция микроРНК была впервые описана на модельном объекте Arabidopsis thaliana, для которого было показано влияние «JAW микроРНК» на регуляцию нескольких генов, контролирующих внешний вид. У растений гены, регулируемые микроРНК, как правило, являются факторами транскрипции, поэтому микроРНК регулируют целые генные сети, изменяя экспрессию ключевых генов (в том числе, факторов транскрипции и белков F-box) в ходе эмбрионального развития. У многих организмов, в том числе и у человека, микроРНК принимают участие в образовании опухолей и нарушении регуляции клеточного цикла. В данном случае микроРНК могут являться как онкогенами, так и супрессорами опухолей.

Последовательности малых интерферирующих РНК и микроРНК комплементарны последовательностям нуклеотидов прототорных участков. Связывание siRNA и микроРНК с этими участками может приводить к повышению транскрипции генов и активации РНК. Увеличение экспрессии данных генов происходит при участии белков Dicer и Argonaute, также происходит деметилирование гистонов.

Выключение генов

Система РНК-интерференции часто используется в экспериментальной биологии для изучения функции генов в культурах клеток и в модельных организмах in vivo. Синтетическую двуцепочечную РНК, комплементарную заданному гену, вводят в клетку или организм, где чужеродная молекула РНК запускает систему РНК-интерференции. Этот метод позволяет исследователям значительно снижать уровень экспрессии соответствующего гена. Изучение последствий снижения экспрессии интересующего гена позволяет выяснить физиологическую роль продукта данного гена-мишени. Так как система РНК-интерференции не может полностью выключить экспрессию гена, данный метод называется «нокдауном гена» — в отличие от полного удаления гена, «нокаута гена».

Значительные достижения в области вычислительной биологии позволяют разрабатывать двуцепочечные РНК, которые обеспечивают максимальное снижение экспрессии гена-мишени и обладают минимальными побочными эффектами. Побочные эффекты могут возникать в случае, когда вводимая молекула РНК имеет последовательность, комплементарную нескольким генам одновременно, что приводит к снижению экспрессии нескольких генов на недостаточную величину. Подобные трудности возникают часто в случае, когда двуцепочечная РНК содержит повторяющие последовательности. Изучение геномов Homo sapiens, Caenorhabditis elegans, и Schizosaccharomyces pombe показало, что около 10 % молекул малых интерферирующих РНК будут приводить к значительным побочным эффектам Разработано значительное количество компьютерных программ для подбора последовательностей малых интерферирующих РНК, в том числе, специфичных для млекопитающих и вирусов. Предлагаемые последовательности siRNA автоматически проверяются на перекрёстную активность.

В зависимости от организма и экспериментальной системы, экзогенные РНК могут быть сконструированы длинными и являться мишенью белка Dicer, либо короткими и являться субстратами малых интерферирующих РНК. Для большинства клеток млекопитающих предпочтительнее использовать более короткие РНК, так как длинные двуцепочечные РНК у млекопитающих вызывают интерфероновый ответ, форму врожденного иммунитета, неспецифической реакции на чужеродный генетический материал. Для ооцитов мыши, а также для клеток эмбрионов мыши на ранних стадиях развития интерфероновый ответ на экзогенные двуцепочечные РНК не характерен, поэтому эти клетки являются удобной системой изучения нокдауна генов у млекопитающих. Для использования системы РНК-интерференции в лабораторных условиях были разработаны специальные методы, не требующие прямого введения малых интерферирующих РНК в клетку, например, системы трансфекции плазмидой, кодирующие транскрибируемые последовательности siRNA, лентивирусные векторы, позволяющие индуцировать или инактивировать транскрипцию, называемые также англ. conditional RNAi.