Тонкослойная жидкостная хроматография

Все описанные ранее варианты жидкостной хроматографии проводят как на колонке, так и на пластинке, т.е. в варианте планарной (плоскостной) хроматографии. Тонкослойную хроматографию отличают следующие достоинства и особенности: это единственный хроматографический метод, позволяющий проводить полный анализ неизвестной смеси, поскольку исследователь имеет возможность проверить, не остались ли на старте неэлюированные компоненты; по производительности превосходит газовую и высокоэффективную жидкостную хроматографию, по крайней мере, на порядок; использует более простое и дешевое оборудование; обладает высокой селективностью, которую легко варьировать, подбирая состав подвижной фазы, и в отличие от ВЭЖХ практически нет ограничений в выборе растворителей.

Положение зоны вещества на хроматограмме характеризуется величиной Rf, которая равна отношению расстояния от стартовой линии до центра зоны вещества к расстоянию от стартовой линии до линии фронта. Rf постоянна для данного соединения в данных условиях и по ней проводят идентификацию компонентов смеси. Rf зависит от строения самого соединения и природы неподвижной и подвижной фазы, а также от условий получения хроматограммы (техники получения хроматограммы, предварительной подготовки пластинки, количества нанесенной пробы, влажности, основы образца).

При хроматографировании в тонком слое сорбента чаще всего применяют адсорбционную нормально-фазовую хроматографию, которая проще по выполнению, более эффективна, а результаты анализа более воспроизводимы. В качестве неподвижной фазы используют полярные адсорбенты: силикагель, окись алюминия, целлюлозу и другие. Подвижная фаза менее полярна. Элюентом служат смеси неполярных растворителей (гексан, толуол, хлороформ и др.) с полярными добавками (ацетон, спирты, уксусную кислоту, амины). Для разделения сильно полярных соединений (аминокислот, углеводов, аминов) используют водно-органические смеси. Сохраняется закономерность – чем полярнее соединение, тем больше удерживание и, следовательно, меньше Rf. Элюирующая способность подвижной фазы тем больше, чем больше ее полярность.

Характерным примером использования ТСХ является разделение аминокислот. Аминокислоты разделяют на пластинках с силикагелем, тогда в качестве подвижной фазы используют смесь спиртов (бутанол, изопропанол) с водой и небольшой добавкой уксусной кислоты. Используют также целлюлозу, аминокислоты элюируют смесями спиртов (метиловый, этиловый) с водой, в качестве добавок используют основания (пиридин) или кислоты (HCl, CH₃COOH). Для разделения сложных смесей аминокислот используют двумерную хроматографию. После элюирования подвижной фазой №1, пластину поворачивают на 90⁰ и продолжают разделение с использованием подвижной фазы №2. Для обнаружения пятен аминокислот на тонкослойных хроматограммах (получения окрашенных пятен) применяют раствор нингидрина или флуоресцирующие реагенты (флуорескамин), что позволяет увеличить чувствительность метода.