Экспрессия генов, интегрированных в хромосомную ДНК прокариотПри встраивании гена-мишени в хромосомную ДНК хозяина необходимо, чтобы сайт интеграции не находился внутри гена, кодирующего важную клеточную функцию хозяина. Для этого чужеродный ген включают в заведомо несущественный сайт хозяйской ДНК. Кроме того, для обеспечения эффективной экспрессии его помещают под контроль регулируемого промотора. Для интеграции в нужный сайт вводимый ген должен содержать нуклеотидную последовательность длиной не менее 50 нуклеотидов, сходную с таковой в хромосомной ДНК хозяина, в пределах которых и должен произойти физический обмен (рекомбинация) между двумя молекулами ДНК (рис. 55). Процесс интеграции состоит в следующем: 1. Идентификация подходящего сайта интеграции, т.е. участка хозяйской ДНК, последовательность которого может быть прервана без ущерба для функционирования клетки. 2. Выделение и клонирование всего хромосомного сайта интеграции или его части в составе плазмидной ДНК 3. Встраивание нужного гена вместе с регулируемым промотором в клонированный сайт интеграции или вблизи него. 4. Перенос полученной генетической конструкции “хромосомный сайт интеграции/клонированный ген” в хозяйскую клетку в составе плазмиды, не способной к автономной репликации в клетках этого хозяина.
Рис. 55. Схема одного из механизмов интеграции генетического материала в хромосому Ген встроен в середину клонированного в плазмиде участка ab, гомологичного участку a'b' в хромосомной ДНК. В результате двойного кроссинговера (Χ-Х) клонированный ген оказывается в составе хромосомы.
5. Отбор и сохранение тех хозяйских клеток, в которые одним из способов детекции (см. раздел библиотека генов) выявляется экспрессия гена-интереса. Наследование клонированного гена возможно только в случае его интеграции в хромосому клеток хозяина.
|
