Скрининг с помощью ДНК-ДНК-гибридизации

Клетки E.coli после трансформации высевают на твердую питательную среду, обеспечивающую рост только трансформированных клеток. Клетки из каждой выросшей колонии переносят на твердую подложку (например, нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр), так, чтобы их расположение соответствовало таковому на чашке, затем лизируют и высвободившуюся ДНК подвергают денатурации и фиксируют на фильтре. На фильтр наносят меченый ДНК-зонд и проводят гибридизацию. Смывают с фильтра негибридизовавшийся зонд и проводят детекцию, чтобы определить, какие клетки содержат меченый ДНК-зонд. Идентифицируют на чашке колонии, содержащие искомую ДНК (положительный гибридизационный сигнал), отбирают из соответствующих клонов клетки и культивируют для выделения рекомбинантной ДНК.

Меченые ДНКзонды можно получить разными способами:

· методом концевого мечения с помощью полинуклеотидкиназы, осуществляющей присоединение dNTP, в котором в ﻻ;-положении по отношению к 5’-углероду дезоксирибозы встроен изотоп фосфора ³²Р;

· методом ник-трансляции с помощью ДНК-полимеразы I;

· методом случайных праймеров, который основан на применении смеси синтетических олигонуклеотидов (олигомеров) в виде затравки для ДНК-полимеразы I (рис. 51). Они представляют собой набор гексануклеотидов, содержащий все возможные комбинации из четырех dNTP.

 

Рис. 50. Скрининг клонов трансформированных клеток E.coli с помощью гибридизации

 

При использовании методов “ник-трансляции” и “случайных праймеров” в суммарный пул dNTP, так называемых “холодных”, т.е. без метки, вводят один нуклеозидтрифосфот, чаще всего dATP, у которого из трех атомов фосфора - тот, который находится в α;-положении по отношении к 5’-углероду дезоксирибозы, представлен изотопом ³²Р или ³³Р. При встраивании такого меченого субстрата в синтезируемую полинуклеотидную цепь, т.е. при образовании новой фосфодиэфирной связи, отщепляется пиррофосфат – атомы фосфора в γ;- и β;-положениях, а ³²Р остается встроенным в сахарофосфатную цепь.

Рис. 51. Схема получения меченых ДНК-зондов с помощью метода “случайных праймеров”

 

Нерадиоактивные системы детекции используют ферментативное превращение хромогенного или хемолюминисцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй – испускает свет.

Последовательности нуклеотидов, которые могут служить ДНК-зондами

для скрининга геномной библиотеки можно получить, по крайней мере, двумя способами: использовать клонированную ДНК близкородственного организма (гетерологичный зонд) либо получить методом химического синтеза, основываясь на известной аминокислотной последовательности белкового продукта искомого гена.