Подготовительные работы при исследовании материала в ИФА

Накануне тестирования исследуемого материала.

1. Приготовление раствора МкАт для сенсибилизации планшетов (раствор 1) в разведении 1:50.

Готовят 30 мл физиологического раствора 0,85%-ной концентрации pH 7,2, вскрывают ампулу с МкАт и вносят в нее 0,6 мл приготовленного физиологического раствора. Затем содержимое ампулы переносят в оставшееся количество физиологического раствора (24,9 мл), тщательно перемешивают.

2. Сенсибилизация планшетов (адсорбция МкАт на планшеты).

Во все лунки планшетов (из набора) вносят по 0,1 мл (100 мкл) раствора 1. Планшеты накрывают крышками, выдерживают в течение 2 часов в термостате при 37⁰ С, затем переносят планшеты на 18-24 часа в холодильник (4⁰ С). При необходимости сенсибилизированные планшеты могут храниться в течение 2 недель при температуре 4⁰ С.

3. Подготовка исследуемого материала и положительного контроля.

Тампоны при исследовании носоглотки или других мест локализации патологического процесса; микроорганизмы в объеме 1 бактериологической петли диаметром 1,5 мм; 1-3 колонии с чашки первичного роста засевают в жидкую питательную среду (см. раздел «Питательные среды»).

Качество жидкой питательной среды проверяют культивированием контрольного (референс) токсигенного штамма коринебактерии дифтерии варианта gravis, который засевают в жидкую питательную среду в объеме 1 бактериологической петли диаметром 1,5 мм.

Пробирки с исследуемым материалом и контрольным штаммом выдерживают в термостате в течение 18 часов при 37⁰ С (при необходимости исследования материала можно провести после 5-часового инкубирования в термостате).

В день постановки опыта готовят рабочие разведения всех компонентов реакции.

1. Приготовление промывающего раствора 2.

Используют 0,05% раствор твина-20, для чего содержимое флакона «Твин-20» полностью переносят в 2 л 0,85% раствора хлорида натрия pH 7,2, тщательно перемешивают (образуется пена). Раствор используют для промывания планшетов, разведения исследуемых проб, коъюгата, положительного контроля. Раствор можно хранить при 4⁰ С до 2-х недель.

 

2. Приготовление рабочего разведения положительного контроля (дифтерийного анатоксина) - раствор 3.

Контроль вводится для оценки чувствительности тест системы. Используют рабочее разведение анатоксина 1:4000, которое готовят методом последовательных разведений. Разведение 1:40 - в ампулу, содержащую 0,05 мл анатоксина, вносят 1,95 мл раствора 2, тщательно перемешивают (хранят при 4⁰ С до 2-х недель). Затем готовят разведение 1:400 - 0,1 мл анатоксина в разведении 1:40 вносят в 0,9 мл раствора 2, тщательно перемешивают; разведение 1:4000 - 0,1 мл анатоксина в разведении 1:400 вносят в 0,9 мл раствора 2, тщательно перемешивают (содержит 0,075 Lf/мл).

3. Рабочие разведения конъюгата, 5-АС и субстратной смеси готовятся непосредственно перед внесением в лунки планшетов (см. раздел «Постановка ИФА»).