Среды для определения биохимических свойствСреды для определения цистиназной активности
Среда Пизу на Мартеновском агаре К 90 мл расплавленного 1,5%-ного мартеновского агара (не допускается использование агара Хоттингера), pH 7,6, добавляют 2 мл 1%-ного раствора L-цистина в 0,1 N растворе соляной кислоты (HCl), тщательно перемешивают и добавляют такой же объем 0,1 N раствора NaOH. Раствор NaOH добавляют к среде для нейтрализации соответствующего количества кислоты. Растворы кислот и щелочей должны быть взаимно оттитрованы, можно использовать фиксанально выпускаемые предприятиями химической промышленности. Среду стерилизуют при температуре 1120 в течение 30 мин, можно сохранять в течение 1 месяца при 40. Агар с цистином расплавляют при 900 (не кипятят) для сохранения цистина. К охлажденной до 450 среде добавляют 1 мл 10%-ного раствора уксуснокислого свинца и 9 мл сыворотки крупного рогатого скота с соблюдением правил асептики и разливают по пробиркам. Необходимо учитывать, что при температуре среды 500 и выше, в присутствии уксуснокислого свинца, сыворотка мутнеет и среда приобретает молочный цвет. Это затрудняет учет результатов реакции.
Среда Пизу на основе коммерческой среды АГВ Для приготовления среды Пизу можно использовать доступную и сбалансированную по составу коммерческую среду АГВ, применяемую в бактериологической практике для определения чувствительности микроорганизма к антибиотикам. Навеску сухой среды АГВ в количестве 2,7 г вносят в 90 мл дистиллированой воды и кипятят ее до полного растворения. Готовят 5%-ный раствор гидрокарбоната натрия. Для этого растворяют 0,5 г NaHCO3 в 10 мл дистиллированной воды. В 10 мл гидрокарбоната натрия внося 0,1 г L-цистина и кипятят до полного растворения цистина. Затем 2 мл кипящего щелочного раствора цистина вносят в 90 мл расплавленной среды АГВ, доводят pH до 7,6 и стерилизуют при 1120 в течение 10 мин. К расплавленной и охлажденной до 450 основе последовательно добавляют: 10 мл сыворотки крупного рогатого скота, 1 мл 10%-ного раствора уксуснокислого свинца, 1,5 мл стерильного свежеприготовленного 10%-ного раствора гипосульфита натрия и разливают по пробиркам. Растворы уксуснокислого свинца и гипосульфита натрия готовят ex tempore, используя стерильные пробирки и дистиллированную воду, стерилизуют текучим паром или на водяной бане в течение 30 мин.
Среды для определения уреазной активности
Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах: путем посева на бульон с мочевиной и по методу Заксе.
Бульон с мочевиной К 100 мл стерильного мясо-пептонного или бульона Хоттингера (pH 7,0) добавляют 1 г мочевины и 0,2 мл 1,6%-ного спиртового раствора индикатора крезолрот. Разливают по 2-3 мл в стерильные пробирки и стерилизую текучим паром в течение 10 мин.
Приготовление реактивов для определения уреазной активности по методу Заксе
Готовятся 2 реактива – А и В. Реактив А: Мочевина................................................................................................2 г 96%-ный этиловый спирт..................................................................... 2 мл Дистиллированная вода.........................................................................4 мл Реактив В: 0,2%-ный раствор фенолрот..................................................................1 мл Однозамещенный фосфат калия (KH2PO4)............................................0,1 г Двузамещенный фосфат калия (K2HPO4)..............................................0,1 г Хлорид натрия.....................................................................................0,5 г Дистиллированная вода.....................................................................100 мл Реактив А не стерилизуют и хранят при температуре 40. Реактив В стерилизуют в автоклаве текучим паром.
Среда для определения сахаролитической активности Для определения сахаролитической активности рекомендуется использовать питательную среду на 1%-ной пептонной воде. К 100 мл горячей дистиллированной воды добавляют 1 г пептона, 0,5 мл химически чистого NaCl и 1 мл индикатора Андреде. Устанавливают pH 7,4, кипятят 5 мин, фильтруют через бумажный или полотняный фильтр, доводят до первоначального объема горячей дистиллированной водой. К полученной основе добавляют один из углеводов: сахароза, глюкоза (в количестве 1 г), растворимый крахмал (0,5 г). Среды разливают в пробирки по 2-3 мл и стерилизуют текучим паром в течение 3 дней по 30 мин или при 0,5 атм 30 мин. Готовые среды с индикатором Андреде бесцветны или имеют слегка розоватый оттенок.
Индикатор Андреде Посуда для приготовления индикатора должна быть сухой, химически чистой, с притертой пробкой. К 100 мл дистиллированной воды добавляю 0,5 г кислого фуксина и 16,4 мл 4%-ного раствора NaOH. Раствор на сутки оставляют при 370, периодически встряхивая, 2-е суток выдерживают на свету и затем убирают в темное место. Свежеприготовленный раствор имеет соломенно-желтый цвет или слегка розовый оттенок, который исчезает в процессе хранения. Интенсивно розовая окраска раствора в процессе приготовления индикатора указывает на необходимость увеличения содержания щелочи до 18 мл.
Среда для определения нитратредуктазной активности К 100 мл питательного бульона (МПБ или бульона Хоттингера) pH 7,3-7,5, свободному от нитритов (проверить реактивом Грисса или Касаткина), прибавляют 0,1 г свободного от нитритов нитрата калия (KNO3). Проверяют еще раз на наличие нитритов и разливают по 2 мл в пробирки, предварительно тщательно промытые проточной водой. Среды стерилизуют 15 мин при 1200.
Реактив Грисса Раствор 1. 0,8%-ная сульфаниловая кислота в 5 N уксусной кислоте. Раствор 2. 0,6%-ная диметил-альфа-нафталамин в 5 N уксусной кислоте. Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин, бесцветен, при появлении розового окрашивания - непригоден. Растворы 1 и 2 хранят при 40 в течение 2 месяцев.
Реактив Касаткина Раствор 1. 0,1%-ный раствор риванола в дистиллированной воде. Раствор 2. 12%-ный раствор соляной кислоты (HCl). Перед выполнением реакции смешивают равные объемы растворов 1 и 2. Реактив годен к применению в течение 15 мин, бесцветен, при появлении розового окрашивания - непригоден. Растворы 1 и 2 хранят при 40 в течение 2 месяцев.
|
