Трансдукция. .Вектор - молекула ДНК или РНК, состоящая из двух компонентов: векторной части (носителя) и клонируемого чужеродного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в клетку-рецепиент и встроить ее в геном. В состав вектора должен входить маркерный ген, позволяющий селектировать измененные клетки. Можно выделить 2 группы маркерных генов: - селективные гены, отвечающие за устойчивость к антибиотикам или гербицидам; - репортерные гены, кодирующие нейтральные для клеток белки, наличие которых в тканях может быть легко тестировано. За способность гена к экспрессии отвечают регуляторные последовательности, которые также необходимо встроить в векторную молекулу. Типы векторов: - бактериальные плазмиды. Одна их наиболее часто употребляемых плазмид для клонирования pBR 322 создана на основе плазмид, выделенных из E. coli; - вирусы. Есть вирусы, которые не ведут к гибели клетки, но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вместе с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т.е. превращают в раковую; - гибридные векторы, содержащие ДНК фага и плазмиды - космиды и фазмиды. 2. Прямое введение гена в клетку – трансформация. Ее виды: Трансфекция. ДНК адсорбируется на кристаллах фосфата кальция. Они поглощаются клеткой путем фагоцитоза. Микроинъекция ДНК с помощью микропипеток диаметром 0.1-0.5 микрона и микроманипулятора. Электропорация основана на том, что импульсы высокого напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомембран. «Мини-клетки» получают путем блокирования донорных клеток в митозе колцемидом. Вокруг каждой хромосомы формируется новая ядерная мембрана. Затем их обрабатывают цитохалазином В и центрифугируют. Образуются мини-клетки - микроядра, инкапсулированные в цитоплазматическую мембрану. Для их слияния подбирают специальные мягкие условия. Упаковка в липосомы используется для защиты экзогенного генетического материала от разрушающего действия рестриктаз. Метод биологической баллистики является одним из самых эффективных на сегодняшний день методов трансформации растений. На мельчайшие частички вольфрама напыляется ДНК вектора. Они помещаются внутрь биолистической пушки, откуда с огромной скоростью выбрасываются и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. С развитием генной инженерии появилась возможность заставить микроорганизмы синтезировать вещества, которые получить другими методами сложно - интерферон, инсулин, соматостатин, соматотропин, фермент урокиназу, некоторые факторы свертывания крови и др. Все эти белки применяются для лечения болезней. Плазмиды можно ввести и в клетки эукариот. Генетическая транформация соматических клеток млекопитающих позволяет изучать тонкие механизмы регуляции экспрессии генов и целенаправленно модифицировать генетический аппарат клетки, что имеет огромное значение для медицинской генетики. Культуры трансформированных клеток млекопитающих используют для получения различных веществ.
|
