Определение активности альдолазы

Цель работы: освоение метода количественного определения активности фермента гликолиза – альдолазы полученной из материала животного и растительного происхождения.

 

Оборудование, реактивы и материалы: водяной термостат, фотоэлектроколориметр, центрифуга, пробирки, пипетки; фруктозодифосфат натриевая соль с массовой долей 1, 08 % рН 7, 4-7, 6 (готовят из бариевой соли ФДФ), 2, 4-ДНФГ с массовой долей 0, 1 %, гидразинсульфат с концентрацией 0, 56 моль/дм³, едкий натр с массовой долей 3 %, трихлоруксусная кислота с массовой долей 10 %, трис-HCl буфер рН 7, 4; раствор фермента – альдолазы.

 

Теоретические сведения

Альдолаза (фруктозо-1, 6-дифосфат-Д-глицеральдегид-3-фосфат лиаза, КФ 4.1.2.13) катализирует обратимое расщепление фруктозо-1, 6-дифосфата (ФДФ) между 3 и 4 углеродным атомами с образованием диоксиацетонфосфата фосфорного эфира изомерной альдотриозы – глицеральдегид-3-фосфата:

 

О

Н₂О₃РОСН₂ Н₂СОРО₃Н₂ Н₂СОРО₃Н₂ НС О

 

Н НО С О + НСОН

НО ОН

 

СН₂ОН Н₂СОРО₃Н₂

ОН Н

диоксиаце- глицеральдегид-

фруктозо-1, 6-дифосфат тонфосфат 3-фосфат

 

 

Продукты распада фруктозо-1, 6-дифосфата – триозофосфаты – образуют с 2, 4-динитрофенилгидразином (2, 4-ДНФГ) гидразон, имеющий в щелочной среде коричнево-фиолетовое окрашивание. По интенсивности окраски, определяемой колориметрически, судят об активности фермента:

 

Н₂СОРО₃Н₂

Н₂СОРО₃Н₂ HN – NH₂ C N – NH

NO₂ NO₂

CH₂OH

C O +

 

CH₂OH NO₂ NO₂

 

диоксиацетон- 2, 4-динитрофенил- 2, 4-ДНФ гидразондиокси-

фосфат гидразин ацетон фосфат

Ход работы

Для определения активности альдолазы в две пробирки вносят по 0, 5 см³ раствора фермента. Условия и ход определения активности альдолазы приведены в таблице.

Пробы	Раствор фермента, см3	Реактивы, условия определения
трис-буфер, см3	ФДФ, см3	Инкубация 38 оС, мин	ТХУ, см3	ФДФ, см3	Инкубац. смесь, см3	NaOH, см3	Инкубация 24 оС, мин	ДНФГ, см3	Инкубация 38 оС, мин	NaOH, см3	Инкубация 24 оС, мин
Опыт	0, 5	1, 0	0, 5		2, 0	-	0, 5	0, 5		0, 5		3, 5
Контроль	0, 5	1, 0	-		2, 0	0, 5	0, 5	0, 5		0, 5		3, 5

 

После реакции в опытном растворе развивается коричнево-фиолетовое окрашивание, интенсивность которой определяют против контроля на ФЭКе (l = 490 нм, кювета с шириной грани 5 мм).

Установив оптическую плотность раствора по градуировочному графику находим альдолазную активность, выраженную в мкмоль диоксиацетонфосфата, образовавшегося в ходе альдолазной реакции.

 

Оформление результатов

 

Полученные результаты вносят в таблицу.

 

Показатели	Пробы
контроль	опыт
Оптическая плотность D Активность альдолазы, мкмоль диоксиацетонфосфата

 

Контрольные вопросы и задания

1. Назовите субстрат для действия альдолазы. Напишите уравнение реакции. Какие продукты образуются под действием альдолазы?

2. На каком принципе основан метод определения активности альдолазы?

3. В чем суть метода определения активности альдолазы?