Качественная реакция на липазу

Цель работы: обнаружение липазы с помощью качественной реакции на продукты ферментативного гидролиза жира молока.

Оборудование, реактивы, материалы: термостат, термометр, пробирки, пипетки вместимостью 1 см³; спиртовой раствор фенолфталеина с массовой долей 1 %, раствор карбоната натрия с массовой долей 1 %; раствор спиртоосажденной липазы с массовой долей 1 %, глицериновая вытяжка панкреатической липазы (поджелудочную железу животного измельчают, заливают глицерином и выдерживают в холодильнике в течение суток. Осторожно сливают глицерин или отфильтровывают).

Теоретические сведения

 

Липазы катализируют гидролитическое расщепление высших триглицеридов до свободных жирных кислот, ди- и моноглицеридов и глицерина. Суммарное уравнение можно представить таким образом

Источником липаз могут быть поджелудочная железа и микроорганизмы. В последнее время возрос интерес к микробным липазам в связи с перспективами их применения в масло-жировой и молочной промышленности.

Ферментативный гидролиз липидов - это гетерогенная реакция, поскольку фермент растворим в воде, а субстрат – нет. Фермент-субстратное взаимодействие протекает на поверхности раздела фаз между агрегированным субстратом и водой. В связи с этим в качестве субстрата берут молочный жир, который находится в естественно диспергированном состоянии в молоке.

Ход работы

Проводится качественная реакция на жирные кислоты, образующиеся при ферментативном гидролизе жира молока. Для этого в две пробирки наливают по 5 см³ предварительно прокипяченного и охлажденного молока. Затем добавляют по одной капле спиртового раствора фенолфталеина с массовой долей 1 % и осторожно (по каплям) раствор карбоната натрия с массовой долей 1 % до розовой окраски. После этого в одну пробирку вносят 1 см³ раствора липазы, в другую – 1 см³ предварительно прокипяченного и охлажденного раствора фермента. Обе пробирки ставят на 25-30 мин в термостат при 37 ⁰С.

Наблюдают за изменением окраски в пробирках, делают выводы.

В первой пробирке розовая окраска исчезает вследствие связывания избыточной щелочи образующимися жирными кислотами:

 

RCOOH + Na₂CO₃ = RCOONa + NaHCO₃.

 

Во второй пробирке окраска не изменяется (остается розовая) ввиду отсутствия реакции гидролиза (фермент инактивирован нагреванием).

 

Оформление результатов

 

Полученные результаты оформляют в виде таблицы.

 

Показатели	Пробы
контроль	опыт
Изменение окраски

 

Контрольные вопросы и задания

 

1. Приведите уравнение гидролитического расщепления жира под действием липазы.

2. К какому классу ферментов относится липаза? Назовите подподкласс этого класса.

3. В чем суть проведения качественной реакции на липазу?

 

Лабораторная работа № 27

Определение липазной активности

 

Цель работы: сравнение липазной активности различных зерновых культур.

Оборудование, реактивы и материалы: водяная баня, колбы мерные на 50 и 100 см³, колба Эрленмейера, резиновые пробки; растительное масло, мука из зерновых культур, раствор гидроокиси калия с концентрацией 0, 01 моль/дм³, фосфатный буферный раствор рН 7, 4; спиртоэфирная смесь (этиловый спирт с массовой долей 96 % и ацетон в соотношении 1: 1), раствор фенолфталеина.

Теоретические сведения

 

Липазы (К.Ф. 3.1.1.3.) относится к классу гидролаз подклассу эстераз. Фермент катализирует гидролитическое расщепление высших триглицеридов.

Липазную активность определяют по начальной скорости ферментативной реакции гидролиза триглицеридов растительного масла, которую рассчитывают по количеству образовавшихся под действием липазы жирных кислот титриметрическим методом.

Липазную активность выражают количеством раствора гидроокиси калия, необходимом для нейтрализации жирных кислот, образовавшихся при ферментативном гидролизе, в 1 г жира.

Ход работы

В колбу емкостью 50 см³ отвешивают 3 г (с точность до 0, 01 г) любого растительного масла, вносят 2 см³ фосфатного буфера, сильно встряхивают. Затем добавляют 1 г муки и 3 мл воды температурой 20 ^оС, закрывают пробкой, перемешивают и ставят в шуттель-аппарат и умеренно взбалтывают в течение 1 ч. Затем смесь количественно переносят в колбу Эрленмейера, остатки со стенок колбы смывают 60 см³ спиртоэфирной смеси.

Жирные кислоты, образовавшиеся при гидролизе жира, тируют раствором гидроокиси калия с концентрацией 0, 01 моль/дм³ с 2-3 каплями фенолфталеина.

Для проведения контрольного опыта в колбу вносят 1 г муки и 3 см³ воды, смесь перемешивают и нагревают 5 мин на кипящей водяной бане. Затем к охлажденной смеси добавляют 3 см³ масла и далее определение проводят аналогично рабочему опыту.

Активность липазы Х, ед/г рассчитывают по формуле

 

 

где a - количество раствора КОН, израсходованного на титро-

вание рабочего опыта, см³;

b - количество раствора КОН, израсходованного на титро-

вание контрольного опыта, см³;

n - навеска жира, г;

К - поправочный коэффициент к раствору щелочи.

 

 

Оформление результатов

 

Полученные результаты вносят в таблицу.

 

Мука из зерновых культур	Объем КОН, см3	Х, ед/г
контроль	опыт
Пшеничная мука
Ячменная мука

 

Контрольные вопросы и задания

1. Что является субстратом для действия липазы? Напишите уравнение реакции. Какие продукты образуются при действии липазы на субстрат?

2. На каком принципе основан метод определения активности липазы?

3. Что принимают за единицу активности липазы?

Лиазы

Лиазы участвуют в реакциях синтеза и распада промежуточных продуктов обмена.

К классу лиаз относятся ферменты, ускоряющие негидролитические реакции распада органических соединений по связям С-С, С-N, C-O и т.д. При этом часто замыкаются двойные связи и выделяются такие простейшие продукты, как СО₂, Н₂О, NН₃ и другие. Некоторые из этих реакций обратимы, и соответствующие ферменты в подходящих условиях катализируют реакции не только распада, но и синтеза.

Одной из важнейших групп ферментов этого класса являются углерод-углерод-лиазы (С-С-лиазы). Среди них особое значение имеют карбокси-лиазы (декарбоксилазы) и альдегид-лиазы. Характерным представителем альдегид-лиаз является альдолаза, катализирующая обратимую реакцию расщепления фруктозодифосфата до фосфотриоз.

Лабораторная работа № 28