Качественный анализ. Разделяемые компоненты образуют на хроматографической пластинке или полоске хроматографической бумаги отдельные зоны (пятна)Разделяемые компоненты образуют на хроматографической пластинке или полоске хроматографической бумаги отдельные зоны (пятна). Примерный вид плоскостной хроматограммы показан на рисунке 15. Если соединения окрашены, то их обнаруживают визуально. Однако большинство хроматографируемых соединений бесцветно, поэтому для их обнаружения используют различные методы, которые можно разделить на несколько групп: физические, химические и биологические. Физические методы. Из физических методов для идентификации пятен наиболее часто применяют флуоресценцию. В этом случае пластинку помещают в УФ излучение (обычно флуоресценция вызывается облучением с длиной волны 254 или 365 нм). При обнаружении соединений, обладающих собственной флуоресценцией, они видны на хроматограмме в виде светящихся разным цветом пятен. Для обнаружения нефлуоресцирующих соединений предварительно пропитывают слой сорбента флуоресцентным индикатором (люминофором). Пятна исследуемых соединений можно наблюдать в виде темных зон на желто-зеленом или голубом фоне (в зависимости от люминофора). Химические методы. При обнаружении соединений химическим методом хроматограмму после окончания разделения обрабатывают различными реагентами. Часто для протекания реакции пластинку необходимо нагревать до определенной температуры. Различают реагенты универсальные, используемые для обнаружения многих соединений, и специфические (групповые), действующие на определенный класс исследуемых соединений. К универсальным реагентам относятся растворы сильных окислителей (например, HNO3, KMnO4 или H2SO4), пары аммиака, брома иода. К специфическим реагентам относится большое количество химических веществ, которые выбирают в зависимости от химических свойств обнаруживаемых веществ. Некоторые из реагентов, используемых для проявления хроматограмм, показаны в таблице 8.
Биологические методы. К ним относятся биоавтография и фермент-субстратная реакция. Их используют для анализа биологически активных соединений. Например, при обнаружении стимуляторов роста или витаминов определяется степень роста зон микроорганизмов, а при обнаружении антибиотиков – степень их ингибирования. Биологические методы обладают высокой чувствительностью и избирательность, однако на их проведение требуются большие затраты времени – от нескольких часов до нескольких дней. Идентификацию соединений в методе ТСХ обычно проводят путем сравнения значений R f пятен анализируемого и стандартного вещества. При этом растворы стандартных веществ наносятся на пластинку рядом с пятном исследуемого вещества и хроматографируются одновременно в тех же условиях. В случае совпадения величин R f (R f ± 0.02) у пятен компонентов исследуемой пробы с пятнами стандартных веществ делают заключение об идентичности соединений. Дополнительным подтверждением идентичности являются одинаковая окраска под воздействием химических реагентов, одинаковая реакция на УФ излучение. Если состав пробы неизвестен или стандартные вещества недоступны, то идентификацию веществ можно проводить, используя литературные данные, описывающие детектирование пятен веществ и их значения R f в соответствующих условиях хроматографирования. Однако такой способ весьма не точен, поскольку полное воспроизведение хроматографических условий в ТСХ весьма затруднительно.
|
