Ход работы. 1. В три пробирки (контрольную и две опытные) вносят по 4 мл 2 %-го раствора белка крови - гемоглобина в 0,06 н растворе соляной кислоты.

1. В три пробирки (контрольную и две опытные) вносят по 4 мл 2 %-го раствора белка крови - гемоглобина в 0,06 н растворе соляной кислоты.

2. Для выравнивания температуры пробирки помещают на 10 мин в термостат при температуре 37 ⁰С.

3. После термостатирования во все пробирки вносят по 1 мл раствора пепсина. В одну из пробирок (контрольную) одновременно с пепсином добавляют 5 мл 10 %-го раствора трихлоруксусной кисло­ты (ТХУ) - для инактивации фермента и осаждения белков.

4. Две опытные пробирки помещают в термостат при температу­ре 37-40 ⁰С. Одну пробу выдерживают в течение 15 мин, другую - 30 мин, после чего в них вносят по 5 мл 10 %-й трихлоруксусной кислоты, дают сформироваться осадку и охлаждают под холодной водой. Содержимое всех трех пробирок фильтруют через бумажные фильтры в чистые пробирки.

5.Для определения содержания тирозина в опытных и контрольной пробах используют по 1 мл соответствующего фильтрата, к которму. добавляют 5 мл 0,5 н NаОН, и 0,5 мл реактива Фолина. Растворы выдерживают 10 мин для развития окраски и измеряют оптическую плотность на фотоэлектроколориметре против воды в кю­вете с толщиной слоя 10 мм при длине волны l = 630 нм (светофильтр № 8).

6. Количество тирозина в пробирках определяют по величине оптической плотности с использованием градуировочного графика (рис. 14).

7. Активность пепсина выражают в тирозиновых единицах (ТЕ):

 

[мкг/мин×мл], (10)

 

где а - количество тирозина в фильтрате опытной пробы, найденное по графику, мкг/мл;

б - количество тирозина в фильтрате контрольной пробы, мкг/мл;

1 - объем исследуемого раствора пепсина, мл;

10 - разведение раствора пепсина в реакционной смеси;

t - время инкубирования, мин.

 

 

 

Рис. 14. Градуировочный график для определения содержания тирозина

 

8. Результаты работы необходимо представить в виде графика кинетики гидролиза белка пепсином, в котором по оси ординат откладывают содержание в исследуемых пробах тирозина в мкг/мл, а по оси абсцисс - время инкубирования проб в мин.

Контрольные вопросы

1. Назовите промежуточные и конечные продукты гидролиза белка.

2. Чем (по условиям опыта) отличается контрольная проба от двух опытных проб?

3. Зачем в пробы добавляют трихлоруксусную кислоту?

4. Почему с увеличением времени инкубирования увеличивается количество тирозина в опытных пробах?