Принцип метода ПЦРВ основе метода ПЦР лежит уникальное свойство НК (как ДНК, так и РНК) - способность к саморепродукции, которая воспроизводится искусственно in vitro. При этом синтезируются только строго специфические фрагменты НК. В связи с этим, прежде чем проводить ПЦР, необходимо узнать нуклеотидную последовательность искомой НК. После этого синтезируются два коротких ДНК-зонда или праймера, которые комплементарны соответствующим участками НК-мишени. Праймер – самый главный элемент в ПЦР, обеспечивающий запуск и специфичность реакции. Таким образом, тест-система для ПЦР состоит из смеси НК испытуемого образца, праймера, дезоксирибонуклеотидов (набора нуклеотидтрифосфатов) и термостабильной ДНК полимеразы (энзима термофильных бактерий Termus aquaticus). Вышеуказанную реакционную смесь подвергают повторным циклам нагревания/охлаждения для денатурации (при нагревании) НК и гибридизации или отжиге (при охлаждении) праймеров с целью синтеза (с помощью ДНК-полимеразы) новых НК. Ход ПЦР схематично показан на рис. 1, где представлены три основных этапа собственно амплификации: денатурации, отжига и синтеза (удлинения) НК. Сама полимеразная реакция проходит автоматически в программируемом термостате – термоциклере (амплификаторе), который может нагревать и охлаждать пробирки с реакционной смесью в очень короткое время. Трехступенчатый цикл, в результате которого получаются точные копии идентифицируемого участка матричной НК, повторяется 30-50 раз в соответствии с заданной программой термоциклера. В первом цикле происходит первое удвоение фрагмента нити НК, ограниченного праймерами, в последующем реакция приобретает каскадный характер (цепная реакция). Это означает, что каждая из нитей служит матрицей для синтеза (полимеризации) нового участка НК, что позволяет увеличивать число копий амплифицируемого фрагмента НК в геометрической прогрессии (рис.2). Течение ПЦР аналогично естественной репликации НК, но при этом строго фиксировано искусственно синтезированным праймером.
Рис. 1. ПЦР: Полимеразная Цепная Реакция
Рис.2. Экспоненциальная амплификация ДНК в ПЦР Так, если один цикл продолжается примерно 3 минуты, то менее чем через 2 часа можно получить около миллиарда копий определяемой последовательности НК. Если в растворе не окажется ни одной молекулы НК с участком, комплементарным внесенным праймерам, даже, несмотря на то, что в растворе будет плавать миллион других молекул НК, реакция ПЦР не пройдет. После 25-30 циклов экспоненциального нарастания продуктов реакции происходит выход на плато из-за истощения трифосфатов, праймеров и повреждений полимеразы. Поскольку праймеры физически включаются в концы ампликонов, этим самым детерминируется продукт ПЦР – фрагмент НК. Кроме того, ДНК-полимераза обладает способностью выбраковывать (редактировать) ошибочные некомплементарные нуклеотиды. Этим достигается высокая специфичность результатов исследования. Продукты ПЦР, или ампликоны, представляющие собой участок синтетической НК, ограниченный праймерами, на конечной стадии ПЦР идентифицируют методом электрофореза в геле.
|
