ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТРеакции гетероциклических оснований в составе моно- и олигонуклеотидов. Общие представления. Природа реакционных центров. Закономерности распределения биогенных элементов по s -, p - и d -блокам; строение атомов каждого органогена, его основные валентные состояния и характерные особенности образуемых им химических связей. Возможные электронные состояния для атомов азота и кислорода. Влияние их на основность, нуклеофильность и комплексообразующую способность биологически важных соединений. Теория резонанса. Электронные эффекты заместителей и их влияние на реакционные центры молекул. Выстраивание логической взаимосвязи между строением вещества, его свойствами и реакционной способности. Типы химических реакций. Влияние пространственной структуры НК на реакционную способность. Реакции присоединения и замещения по атомам углерода. Галоидирование в неводной среде как пример реакций электрофильного замещения по положению С5. Реакции свободно-радикального замещения по СН3-группе тимидина. Реакция присоединения-отщепления по двойной связи С5-С6 пиримидинов: галоидирование и меркурирование в водной среде; взаимодействие с бисульфитом натрия. Окисление четырехокисью осмия. Действие гидразина и его производных. Реакции переаминирования как способ введения реакционноспособных групп и меток по С4-положению цитидина. Модификация пуринов по С8-положению. Реакции присоединения по атомам азота пиридинового типа. Реакции алкилирования диазометаном; действие азотистых ипритов. Механизм алкилирования ароматическими и алифатическими ипритами. Реакция с диэтилпирокарбонатом. Реакции по атомам азота пиррольного типа и экзоциклическим аминогруппам. Взаимодействие с азотистой кислотой. Ацилирование. Взаимодействие с диазометаном. Реакции расщепления и перегруппировки гетероциклических оснований нуклеиновых кислот и их производных. Расщепление имидазольного цикла пуриновых производных. Расщепление ДНК по гуанозиновым звеньям через модификацию диметилсульфатом. Алкилирование остатка аденозина и перегруппировка Димрота. Раскрытие пиримидинового цикла. Расщепление ДНК по остаткам цитозина гидразином при высокой концентрации NaCl. Деградация ДНК по остаткам пиримидинов после обработке гидразином в отсутствие NaCl.
ПОДХОДЫ К УСТАНОВЛЕНИЮ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ В ДНК И РНК Метод перекрывающихся блоков – основной подход для восстановления порядка расположения фрагментов в исходной цепи ДНК. Расщепление ДНК ферментами рестрикции по специфическим сайтам. Физические карты ДНК. Банки данных для последовательностей нуклеотидов в нуклеиновых кислотах. Метод Сэнгера (определение последовательности ДНК методом ДНК-полимеразного копирования в присутствии терминирующих аналогов дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов). Использование в качестве терминаторов репликации дидезоксинуклеотидов с флуоресцентными метками. Донорно-акцепторные пары для одноволнового возбуждения флуоресцентного красителя с последующей многоволновой детекцией. Методы быстрого определения последовательности РНК. Прямые методы секвенирования РНК. Введение меченых фосфатных групп в 5’- или 3’-концевые звенья РНК. Ферменты, специфически расщепляющие РНК. Секвенирование РНК через кДНК. Пиросеквенирование. Закрепление ДНК-матриы на носителе. Способы детекции пирофосфата после очередного удлинения растущей цепи. Преимущество параллельного пиросеквенирования перед методом Сенгера. Проблема определения минорных компонентов нуклеиновых кислот. Роль масс-спектрометрии при секвенировании нуклеиновых кислот с модифицированными гетероциклическими остатками. Секвенирование нуклеиновых кислот гибридизацией на олигонуклеотидных чипах. Применение ПЦР в секвенировании. Детекция инфекционных агентов, мутировавших генов.
|
