Гельпроникающая хроматография

Гель-фильтрация (gel filtration) [лат. gel(are) — застывать; лат. filtrum — войлок] — метод очистки ДНК и белков, в котором используется разделение компонентов сложной смеси на основании различий молекул в размерах и форме. Матрицами для Г.-ф. служат обычно гели на основе декстрана (сефадексы) или агарозы (сефарозы), частицы которых характеризуются определенным средним диаметром и проницаемы благодаря внутренним каналам. Разделение веществ проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля. Смесь белков наносят на колонку, а затем элюируют буферным раствором. Молекулы, не способные проникать в гранулы геля, будут перемещаться с высокой скоростью, а молекулы меньших размеров будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Метод Г.-ф. предложен в 1959 г. Д. Поратом и П. Флодиным, которые показали возможность фракционирования водорастворимых макромолекул (на примере белков) по молекулярной массе на сшитым декстрановом геле.

 

Физические основы этого метода очень просты и наглядны. Исследуемый раствор полимера протекает через колонку, наполненную пористым сорбентом. Разделение смесей компонентов основано на распределении вещества между подвижной (текущий растворитель) и неподвижной (растворитель в порах сорбента) фазами, т. е. на разной способности макромолекул полимера проникать в поры гранул геля, откуда и произошло название метода.

Поверхность гранул сорбента покрыта множеством каналов, углублений и других неровностей, условно называемых порами. Объем, недоступный для растворителя, называют мертвым объемом. Если же размер молекул больше размеров пор, то такая молекула проходит мимо гранулы геля, не задерживаясь, т. е. исключается (exclusion) из порового пространства. Таким образом, макромолекулы большего размера протекают через колонку быстрее. Это означает, что различные молекулы полидисперсного образца будут выходить из колонки в разное время при различном удерживаемом объеме.

 

Наибольшее применение в качестве сорбента получили гели гидрофобных материалов, например полистирола, сшитого дивинил - бензолом: В таких гелях практически полностью отсутствуют эффекты адсорбции анализируемых проб. В последнее время широко распространены макропористые стекла, которые обладают по сравнению с полимерным сорбентом рядом преимуществ (жесткость частиц, варьирование размеров пор, химическая стабильность) и недостатков (повышенная сорбция на них полимеров).

 

Наиболее употребительными растворителями являются тетра-гидрофуран (ТГФ), хлороформ, толуол, циклогексан и их смеси. Предпочтение отдается ТГФ, который, в отличие от толуола, не образует мицелл или агрегатов с макромолекулами полимера и прозрачен в УФ - области спектра. Кроме того, эффективность метода при использовании ТГФ максимальна при довольно низких температурах (35-45 °С). Однако при длительном хранении ТГФ окисляется с образованием взрывоопасных пероксидных соединений, поэтому необходимо проводить его предварительную очистку. Используя ТГФ в качестве растворителя, можно анализировать каучуки всех марок, а также термоэластопласты.

Впервые прибор для гель-хроматографического анализа полимеров выпущен фирмой "Waters" в 1964 году, спустя пять лет после Открытия метода. Сегодня жидкостные хроматографы для анализа Молекулярно-массового распределения (ММР) полимеров выпускаются во всех промышленно развитых странах, в России известны хроматографы серии ХЖ.

ГПХ позволяет изучить тонкие изменения в химической структуре полимеров и определить полное ММР, а потому широко используется в химии полимеров. В промышленном производстве эластомеров метод ГПХ может быть применен для оперативного контроля качества серийно выпускаемой продукции и соответствующей корректировки технологического процесса, а также при разработке и совершенствовании технологии получения эластомеров с заданными свойствами. Гель-хроматографы можно включать в автоматизированные системы управления технологическими процессами с отбором проб на анализ непосредственно из реактора. Длительность анализа, включая подготовку пробы, составляет 20-30 минут.

 

Недостатки гель-проникающей хроматографии

У метода гельпроникающей хроматографии есть и недостатки. В этом методе на самом деле мы определяем не столько массу молекулы полимера, сколько ее гидродинамический объем, то есть сколько места конкретная молекула полимера занимает в растворе. Мы можем приблизительно вычислить молекулярную массу по данным гель-хроматографии, поскольку мы знаем точное соотношение между молекулярной массой и гидродинамическим объемом для полистирола, а мы используем полистирол в качестве стандарта для калибровки колонок для ГПХ. Но соотношение между гидродинамическим объемом не одинаково для всех полимеров, поэтому наши измерения являются не абсолютно точными, а только приблизительными.

Системы гель проникающей хроматографии (GPC/SEC):