Терминальная трансфераза, поли-А - полимеразаТерминальная трансфераза (терминальная дезоксинуклеотидил трансфераза) катализирует присоединение мононуклеотидов к 3'-OH концу ДНК-затравки, в процессе присоединения мононуклеотида отщепляется пирофосфат. Одноцепочечная ДНК служит наиболее эффективной затравкой. Терминальная трансфераза является в определенном смысле полимеразой, поскольку она катализирует синтез полидезоксирибонуклеотидов из дезоксирибонуклеозидтрифосфатов с высвобождением неорганического пирофосфата. Подобно ДНК-полимеразам она требует присутствия праймера со свободной 3’-гидроксильной группой. Однако, ей не нужна матрица, она вообще не способна копировать что-либо вообще и продуктом катализируемой ею реакции является одноцепочечный полимер (рис. 12).
Рис. 12. Реакция, катализируемая терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой. N- любой из четырех дезоксинуклеотидов: A,T,G или С
Терминальная трансфераза в присутствии в качестве кофактора ионов Mg2+ использует в качестве затравки одноцепочечную ДНК с З'-ОН концом или двухцепочечную ДНК с выступающим одноцепочечным З'-ОН концом. Если в качестве кофактора используются ионы Co2+, этот фермент может катализировать присоединение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН концу двухцепочечной ДНК с тупыми концами. При введении в реакцию, направляемую терминальной трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образуются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 3'-концы. Таким же образом можно достроить другим молекулам ДНК гомополимерные 3'-концы, комплементарные первым. Смешение полученных препаратов ДНК при определенных условиях может приводить к формированию гибридных молекул ДНК. Именно с помощью концевой дезоксинуклеотидилтрансферазы в 1972 г. был выполнен первый эксперимент по рекомбинации молекул ДНК in vitro. С помощью дезоксинуклеотидилтрансферазы к молекулс ДНК, не имеющим липких концов, можно присоединять такие концы. Подобно терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазе поли(А)-полимераза присоединяет нуклеотидные остатки к 3’-ОН концу одноцепочечных молекул без матрицы. Однако поли(А)-полимераза проявляет специфичность, осуществляя независимое от матрицы последовательное присоединение остатков аденилата к 3'-OH-концам молекул РНК в соответствии со следующей реакцией: РНК + nATP -> РНК(А)n + nPPi. Поли(А) – полимераза выполняет высокоспециализированную и важную функцию в экспериментах с рекомбинантными ДНК: подготовка РНК к копированию с них комплементарной ДНК. Кроме того, ее применяют для введения радиоактивной метки в 3’-конец РНК.
|
