Зак. 1712.

Государственная фармакопея Республики Беларусь

 

геля, накрывают другим листом, удаляют воздушные пузырьки и завершают сборку рамки высушивания. Рамку помещают в сушилку и оставляют при комнатной температуре до высыхания геля.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ

Молекулярные массы белков определяют, сравнивая их подвижность с подвижностью маркерных белков с известной молекулярной массой. Для градуирования гелей используют доступные готовые смеси равномерно окрашиваемых маркерных белков с точно известными молекулярными массами. Такие смеси доступны для различных диапазонов молекулярных масс. Концентрированные растворы белков с известной молекулярной массой разводят соответствующим буферным раствором для образцов и наносят на тот же гель, что и испытуемый образец.

Сразу после проведения электрофореза фиксируют электрофоретический фронт красителя бромфенолового синего. Это можно сделать нанесением насечки на край геля или введением иглы, смоченной индигокармином, в гель на линии фронта красителя. После окрашивания измеряют пройденное расстояние каждой белковой полосы (известной и неизвестной) от верха разделительного геля. Расстояние, пройденное -а-дым белком, делят на расстояние, пройденное красителем. Полученные результаты называются относительной подвижностью белков (относительно фронта красителя) и условно обозначаются R_r Строят график зависимости логарифма относительных молекулярных масс (М. м.) маркерных белков от условно полученных значений R_r Обычно график имеет слегка сигмовидную форму. Неизвестные молекулярные массы определяют с помощью линейной зависимости или интерполяцией графика зависимости Ig М. м. от R_r если значения, полученные для неизвестных образцов, располагаются на линейной части графика.

ВАЛИДАЦИЯ ИСПЫТАНИЯ

Результаты испытания признаются достоверными, если белки, которые являются маркерами молекулярных масс, расположены вдоль 80 % длины геля и по всей области разделения (то есть области, включающей образец и его димеры или образец и сопутствующие примеси), разделение соответствующих белковых полос проявляет линейную зависимость логарифма молекулярной массы от R_f Дополнительные требования к валидации по отношению к испытуемым растворам указываются в частной статье.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИМЕСЕЙ

Если в частной статье указывают предел содержания примесей, в испытании необхо-

димо использовать раствор сравнения соответствующего разведения. Например, если предел содержания примесей составляет 5 %; необходимо использовать раствор сравнения, разведенный по отношению к испытуемому раствору в соотношении 1:20. На электрофореграмме испытуемого раствора ни одна примесь (ни одна полоса, кроме основной) не должна быть интенсивнее основной полосы на электрофореграмме раствора сравнения.

Для валидированной методики содержание примесей может определяться методом внутренней нормализации по отношению к основной полосе с использованием интегрирующего денситометра. При валидации методики необходимо подтвердить линейность сигнала.

01/2013:20232