Очистка афтозного вирусного материала с помощью ультразвука

Эффективность электронно-микроскопических исследований материалов в диагностических целях, приготовленных из афт больных животных, возрастает при наличии вируссодержащих препаратов с достаточно высокой степенью очистки от балластных белков. При решении данной проблемы для получения очищенных препаратов из минимальных количеств афтозного вирусного материалов, взятых от больных животных, использовали ультразвуковой дезинтегратор (1-2 г афт)

Ультразвуковой диспергатор

.

Для приготовления 10% суспензии афтозного вируса стенки афт отмывали физиологическим раствором рН 7,4-7,6, высушивали фильтровальной бумагой, взвешивали, измельчали и затем растирали в ступке с битым нейтральным стеклом до получения однородной массы. К афтозному материалу добавляли буферный раствор в соотношении 1:10 и суспензию, после экстрагирования при комнатной температуре в течение 2 часов, замораживали.

После размораживания для дополнительной дезинтеграции тканевых агрегатов и вирусных частиц суспензию подвергали ультразвуковой обработке. Стакан с суспензией помещали в чашку со льдом и ставили на подъёмный столик ультразвукового дезинтегратора типа MSE 500 c частотой 20 000 Гц. Гидравлическим подъёмником столик поднимали до соприкосновения вибратора с поверхностью обрабатываемой жидкости. Озвучивание проводили в состоянии резонанса при интенсивности 80-100 вт/см² в течение 20-30 сек. Затем к суспензии добавляли 5 мл хлороформа и повторяли обработку при тех же параметрах.

В результате обработки ультразвуком смеси суспензия – хлороформ получали гомогенную эмульсию, которую затем центрифугировали при 2 000 g в течение 15 мин. Эмульсия разделялась на две фазы: надосадочную водную, содержащую вирус, и осадок белка, денатурированного хлороформом.

Водную фазу, представляющую собой очищенную вирусную суспензию, отбирали в стерильную посуду и использовали для приготовления препаратов для электронной микроскопии. В условиях негативного контрастирования вирусных препаратов 2% раствором ФВК рН 6,8 в поле зрения электронного микроскопа наблюдали однородные по форме и размерам вирусные частицы. Микрофотографии и гистограмма распределения размеров афтозного вируса ящура А₂₂ представлены на рис. 3.5. Из гистограммы следует, что при среднем диаметре равным 28,6 + 0,5 нм размеры вирионов варьируют в пределах от 25 до 33 нм.

Вирионы афтозного вируса типа О имеют средний диаметр 29,9 + 0,6 нмс вариацией размеров вирионо в пределах от 23 до 33 нм. Замер диаметра проводили не менее чем у 100 частиц.

В отдельных препаратах, приготовленных из свежеполученных афт КРС, одновременно наблюдали от 5 до 20 вирионов. Для подтверждения факта присутствия именно вирионов вируса ящура последние обрабатывали раствором ФВК с кислым значением рН. Если при контрастировании вирусных препаратов 2% раствором ФВК рН 6,0 вирусные частицы не выявлялись, давалось предварительное заключение о выявлении вирионов вируса ящура. Дополнительные сведения по идентификации вируса получали с использованием иммунной электронной микроскопии по общепринятой методике.

Основой всех методических приемов техники иммунной электронной микроскопии (ИЭМ) является смешивание вирусной суспензии с гомологичной антисывороткой, приводящее к формированию иммунных комплексов, легко выявляемых в электронно-микроскопических препаратах [Королев М.Б,1980]. Характерные комплексы из вирионов афтозного вируса ящура А₂₂ приведены на рис. 3.5б.

К достоинствам данного метода очистки относится то, что интенсивная кратковременная ультразвуковая обработка создает оптимальные условия для экстрагирования вирусных частиц из измельченной ткани. При обработке вирусной суспензии в смеси с хлороформом образуется гомогенная мелкодисперсная эмульсия с огромной поверхностью органической фазы, что приводит к более полной избирательной денатурации балластных белков.

Кроме того, ультразвуковые волны сообщают частицам высокую кинетическую энергию, в результате чего наблюдается интенсивная коагуляция денатурированного белка, который затем легко удаляется при центрифугировании. При использовании в работе афтозного материала хранившегося продолжительное время в 50%-ном глицерине (до 2 лет) было достаточно проведения однократной очистки при помощи ультразвука. Для суспензий, приготовленных из свежих от крупного рогатого скота, необходима двукратная очистка этим способом [Пономарев А.П. и др., 1978].

Таким образом, очистка вирусной суспензии с применением ультразвука обеспечивает дополнительное экстрагирование вирусных частиц из тканевых частиц, значительно сокращает время и дает возможность качественно очищать минимальные объёмы вирусной суспензии (10-20 мл).