ОКИСЛЮВАЛЬНЕ ФОСФОРИЛЮВАННЯ

Процеси біологічного окисления, що проходять у клітинах гетеротрофних організмів, є основним джерелом eнepriї, необхідної для забезпечення їхньої життедіяльності. Eнepгія, що виділяеться при анаеробному та аеробному окис-ленні різних субстратів, нагромаджується в макроерпчних зв'язках АТФ — універсальної сполуки, яка може виступати в ролі акумулутора, трансфор-матора та донора енергії. Близько 50 % енергії окис­лення органічних сполук резервується в макроергічних зв'язках АТФ. Утворюється АТФ з АДФ i активного фосфату, причому активація останнього i перетворення його на активний фосфорил проходять за рахунок енергії окислення органічних сполук. Синтез АТФ з АДФ і неорганічного фосфату, активація якого спряжена з процесами окислен­ня в організмі називаеться фосфорилюючим окисленням. Залежно відпринципу енергетичного спряжения розрізняють фосфорилююче окис­лення на piвнi субстрату та на piвнi електронно-транспортного ланцюга. Фосфорилююче окислення на piвнi субстрату — це синтез АТФ з АДФ i активного фосфорилу внаслідок перенесення його з продукту окислення субстрату на АДФ. Так синтезуеться незначна кількість АТФ. Реакція фосфорилюючого окислення на piвнi субстрату здійснюється зокрема в процесі анаеробного окисления вуглеводів. Так, у процесі окислення глюкозо-6-фосфату утворюеться субстрат, що має макро-ергічний зв'язок — 1,3-дифосфогліцеринова кислота, яка може передавати активний фосфорил на АДФ, внаслідок чого утво­рюеться молекула АТФ:

У npoueci глшол1зу проходить ще одна реакщя фосфорилюючого окисления (на piBHi субстрату) — при перенесенш активного фосфори­лу з фосфоенолшрувату, продукту окисления глюкозо-6-фосфату на АДФ.

На третьему етапі виділення енергії (під час аеробного окислення в циклі Кребса), також відбувається реакція фосфорилюючого окислен­ня на piвнi субстрату — під час перенесення активного фосфорилу з сукцинілфосфату на ГДФ, утворена молекула ГТФ вступае в обмінну реакцію АДФ, внаслідок чого утворюється молекула АТФ: ГТФ + АДФ →АТФ + ГДФ.

Другий вид енергетичного спряження —фосфорилююче окислення на piвнi електронно-транспортного ланцюга —здійснюється в процесітканинного дихання або біологічного окислення на piвнi електронно-транспортного ланцюга.

Було встановлено, що в процесі біологічного окислення під час перенесення протонів та електронів по системі дихального ланцюга, спряжених з процесами окисления, на певних його делянках відбуваються активування неорганічного фосфату i перетворення його на активний фосфорил, який взаємодіє з АДФ i забезпечуе синтез АТФ. При перенесенні електронів посистемі дихального ланцюга вільна енергія системи поступово зменшується.

Згідно з розрахунками, стандартна змінa вільної енергії системи при перенесенні двох електронів по системі дихального ланцюга становить 220 кДж, що достатньо для синтезу 6—7 молекул АТФ (враховуючи, що вільна енергія гдролізу АТФ в середньому дорівнюе 30,6 кДж; 220: 30,6 — 7). Однак дослідженнями було встановлено, що при пере­несенні двох електронів по системі дихального ланцюга синтезуеться лише три молекули АТФ, тобто існує три пункти спряження, на яких процес окислення забезпечує активацію неорганічного фосфату i пере­несення активного фосфорилу на АДФ. Саме на цих ділянках рівень зміни вільної енергії системи достатній для синтезу АТФ:

Перша молекула АТФ синтезується при перенесенні електронів i |протонів від нікотинамідних до флавінових коферментів, друга—при перенесенні електронів від цитохрому b до цитохрому с, третя — утво­рюється на ділянці перенесення електрошв з цитохромоксидази (а, а-_л) накисень. Отже, під час окислення двох aтомів водню в дихальному ланцюгуутворюється три молекули АТФ.

Ступнь спряження окислення i фосфорилювання може бути pізним, залежновід умов та стану клітини. Показником спряження окислення i фосфорилювання коефіцієнт Р/О (коефіцієнт фосфорилювання) або

відношення зв'язаного неоргаічного фосфату до поглиненого в npoueci дихання кисню (Р/О = 3, якщо первинною депдрогеназою є НАД+ i Р/О = 2, якщо водень з субстрату відщеплює флавінові дегідрогенази). Інтенсивність процесу фосфорилюючого окислення регулюється співввідношенням АТФ/АДФ. Чим менше це воно, тим інтенсивніше відбувається процес дихання та утворення АТФ.

Фосфорилююче окислення на piвнi електронно-транспортного ланцюга вібуваеться в мітохондріях. Ферментні системи, що каталізують даний процес, локалізовані у внутрішніх мембранах мітохондрій. Враховуючи їхні функції в спряжених процесах окислення i фосфорилювання

Конформаційні гіпотези. Ці гіпотези пояснюють синтез АТФ з АДФ i неорганічного фосфату внаслідок конформаційних пepexoдів, які виникають під час час окислення. Проте гіпотези експериментального підтвердження не знайшли, хоч oкремi моменти їх були використані П. Мітчеллом при розробці хеміосмотичної концепції спряження процесів окислення та фосфорилювання на piвнi електронно-транспортно­го ланцюга, яка нині є загальноприйнятою. Основним постулатом гіпотези є те, що під час функцюнування електронно-транспортних ланцюгів виникає осмотична енергія (енергія концентраційного градієнта), яка використовується для здійснення xiмічної роботи — синтезу АТФ (звідки i назва — хеміосмотична гіпотеза), тобто передбачає перехід хімічної енергії, що виділяється при транспорті електронів, на градієнт мембранного електрохімічного потенціалу ioнів водню та перетворення на стабільну eнepгію макроергічних зв'язків АТФ. Рушшною силою процесу фосфорилювання е rpaflieHT електро-xiмiчнoгo потенціалу протонів водню (Д|лН+), що виникає на мембрані

Hинi icнyє кілька пояснень механізму спряження окисления i фос­форилювання. Суть більшості з них полягає в тому, що процес спря­ження здійснюється внаслдок використання eнepгії' при нагромадженні пpoтонів (H+) в активному центрі H+ — АТФ-азної си­стеми, розмщеної у факторі F_x.. Нагромадження їх призводить до активації неорганічного фосфату, утворення активного фосфорилу, зв'я заного з 5-субодиницею фактора F_u внаслідок зняття з нього групи ОН та видалення води у матрикс. Одночасно відбувається й активація АДФ, зв'язаного з цією самою субодиницею фактора F_x пicля втрати протона при взаемодії з групою ОН матрикса. Активований фосфат i АДФ, сполучаючись, утворюють молекулу АТФ. Зпдно з шшою концепщею, утворення АТФ вщбуваеться так: протони Н+ в активному центрi спряжуючого фактора активують фосфат i карбоксильну групу однієї з субодиниць фактора F_lt внаслідок чого утворюється фосфоензим з макроергічним зв'язком. При взаемоди АДФ з фосфоензимом утворюеться АТФ. Існуе також припущення, що роль протонів Н+ полягає у зміні конформації фактора F_t i що саме конфор-мації видозміненого активного центру Н+ — АТФ-азного комплексу є рушійною силою для синтезу АТФ.

Фермент альдегіддегідрогеназа — продукт життєдіяльностi мікроорганізмів, які попадають у молоко з навколишнього середовища. Він каталізує окислення альдегідів (наприклад, мурашиного, оцтового). При добавлянні до сирого молока мурашиного альдегіду i метиленового синього фермент окислює альдегід через гідратну форму до мурашиної кислоти, а водень, що виділяється, відновлює метиленовий синій в без-барвну сполуку (лейкооснову). Схематично це можна показати так:

 

 

Кип'ятіння молока денатурує фермент альдегіддегідрогеназу i тому кип'ячене молоко не окислюе мурашиний альде­гід. Цією реакцією можна відрізнити кип'ячене молоко від сирого.

Виконання досліду. В першу npo6ipкy (досліджену) наливають 2 мл сирого молока, у другу — 2 мл кип'яченого. В обидві npoбipки добавляють по 0,5 мл розчину мура­шиного альдегіду i по 2 краплі розчину метиленового синьо­го. Вміст npoбipoк заливають тонким шаром олії для створення анаеробних умов i вміщують їх на водяну баню при температypi 55 °С. Поступове знебарвлення метиленового синього (перехід у відновну форму) спостерігають тільки в пробірці з сирим молоком.

Роблять висновок про можливість пepeбiгy біологічного окислення в анаеробних умовах. Результати досліду записують у таблицю за формою:

Номер пробірки	Вміст пробірки	Забарвлення в пробірці
до нагрівання	після нагрівання

 

Запитання і завдання для самоконтролю.

 

1. Другий закон термодинаміки, і його значення для розуміння процесів обміну речовин і енергії в живих організмах.

2. Біологічне окислення, його подібність і відмінність від окислення в неорганічній природі.

3. Ланцюг ферментів біологічного окислення, принципи організації і функціонування.

4. Будова коферментів НАД, ФАД, КоQ, Окислені і відновлені форми.

5. Окислювальне фосфорилювання. Синтез АТФ, хеміоосмотична теорія Мітчела.