Молекулярні основи відповіді на оксидативний стрес

 

1. Що таке оксидативний стрес?
2. Відповідь бактерій на оксидативний стрес
3. Відповідь дріжджів на оксидативний стрес

 

1. Що таке оксидативний стрес?

Оксидативний стрес (ОС) пов’язаний із метаболізмом кисню в клітині. Молекулярний кисень О₂ метаболізується організмом за такою схемою:

 

 

 

Основний напрямок мететаболізму кисню – це чотириелектронне відновлення його в електронно-транспортному шляху мітохондрій. Термінальним ферментом електронно-транспортного ланцюга є цитохромоксидаза. Таким шляхом метаболізується більше 90% кисню, який споживається клітиною. Дві молекули води – кінцевий продукт відновлення в ньому. Менше 10% кисню метаболізується за іншим напрямком – шляхом послідовного одноелектронного відновлення молекули О₂. Послідовне включення електронів призводить, в основному, до утворення особливо активних речовин – радикалів. Радикалом називають атом чи молекулу, яка містить неспарений електрон на зовнішньому енергетичному рівні. Саме цей електрон і є причиною небувалої хімічної активності радикалів. Включення електронів на зовнішній електронний рівень кисню проходить наступним чином:

 

 

 

На зовнішньому енергетичному рівні кисню є 2 неспарені електрони, які згідно принципу Паулі рухаються по двох різних орбіталях, адже мають однонаправлені спіни. Електрон, який приєднується до молекули кисню, потрапляє на одну з орбіталей і, таким чином, вона стає повністю заповнена. Електрон на іншій орбіталі залишається неспареним. В результаті приєднання одного електрону до молекули кисню утворюється супероксиданіон-радикал. На наступному етапі відновленя кисню при включенні ще одного електрону за участю двох протонів, які завжди є в клітині, відбувається утворення молекули пероксиду водню Н₂О₂. Пероксид водню не є радикалом, оскільки зовнішні електронні орбіталі кисню в ньому заповнені. Однак, разом з тим для Н₂О₂ характерна висока хімічна активність. Приєднання електрону до молекули Н₂О₂ зумовлює утворення гідроксид-аніону та гідроксид-радикалу. Останній є надзвичайно реакційно здатним.

Супероксиданіон-радикал, пероксид водню та гідроксид-радикал називають активованими формами кисню (АФК). Reactive oxygen species (ROS) – англійський еквівалент. Саме з існуванням АФК пов’язане поняття оксидативного стресу, тому вивчення процесів, які проходять за участю АФК в клітині, має велике значення для фундаментальної науки. Разом з тим не відкидається і прикладний аспект, адже більшість хвороб викликаються оксидативним стресом (АФК) чи при їх розвитку виникає оксидативний стрес.

Для того, щоб зрозуміти суть поняття „оксидативний стрес” розглянемо такий приклад. Нехай маємо басейн з водою, який містить дві труби різного діаметру. По них надходить і виходить вода. Р₁ – потік води, яка надходить в басейн, Р₂ – потік води, яка витікає звідти. За певних умов цілком можливо те, що об’єм води, яка потрапляє в басейн і об’єм води, яка виходить з нього, будуть приблизно однакові, тобто Р₁ = Р₂. Такі умови прийнято називати стаціонарними.

 

 

Рис. 9.1. Баланс між рівнем АФК і системами антиоксидантного захисту.

 

Розглянемо тепер іншу систему, подібну до вище описаної. В неї, на відміну від попередньої, рівень води повинен зростати. Цього можна досягнути різними шляхами: через підвищення Р₁, при зменшенні Р₂, чи з комбінацією цих умов. Разом з тим, якщо пам’ятати, що труби, по яких надходить і виходить вода з басейну, різного діаметру і припустити, що d₁<d₂, то при незначному збільшенні потоку Р₁, Р₂ практично не зміниться, хоча об’єм води в басейні зростатиме. Звичайно, до певної межі. Повертаючись до визначення оксидативного стресу із використанням згаданого прикладу, говоримо, що оксидативний стрес – це підвищення стаціонарної концентрації АФК внаслідок переважання процесів утворення АФК над процесами їх знешкодження.

Захист від АФК відбувається за участю двох систем – низько- та високомолекулярних антиоксидантів. Низькомолекулярні антиоксиданти містяться, в основному, в продуктах рослинного походження. До них належать аскорбінова кислота (віт. С), β-каротини (віт. А), токофероли (віт. Е), флавоноїди, трипептид глутатіон. Серед високомолекулярних є спеціалізовані та неспеціалізовані антиоксидантні ферменти. Ключовими антиоксидантними ферментами є супероксиддисмутаза та каталаза. Cупероксидисмутаза каталізує реакцію утворення пероксиду водню при одноелектронному відновленні супероксид-аніону:

 

 

 

Гідроксидний радикал ^· ОН – найактивніший кисневий радикал, він має дуже короткий час життя з невеличким пробігом. Але високомолекулярні антиоксиданти не здатні нейтралізувати його безпосередньо, частковий захист надають низькомолекулярні антиоксиданти. Тому всі сили організму направлені на перешкоджання утворення ^· ОН. В цьому процесі задіяна ціла система пероксидаз, одна з них – каталаза прискорює утворення води та кисню із пероксиду водню.

 

 

Високі концентрації АФК, без сумніву, негативно впливають на живу клітину. Тому стаціонарна концентрація АФК не перевищує 10^-8 моль. Однак виявлено існування цілих клітинних систем, які за певних умов продукують АФК. Особливо виражені такі процеси у клітинах імунної системи (фагоцити). В них АФК використовуються для знешкодження чужорідних агентів.

2. Відповідь бактерій на оксидативний стрес

E. coli – кишкова паличка – модель для вивчення метаболізму АФК. Подібними модельними системами є клітини B. subtylis і S. typhymirium. У регуляції концентрації кисневих метаболітів у E. сoli задіяна ціла система генів та їх білкових продуктів. На сьогодні відома загальна схема такої регуляції за участю SoxRS -регулону:

 

О₂ ^{· -} → SoxR → soxS → іРНК ^soxS → SoxS → SoxRS →; гени білків-антиоксидантів

 

Зростання концентрації супероксид-аніону активує (окислює) білок SoxR. Він, в свою чергу, підвищує експресію гену soxS, а також утворення іРНК ^soxS та відповідного білка SoxS. Останній стимулює експресію генів, які здатні підвищувати стабільність організму до АФК (зокрема, гену Mn-супероксиддисмутази). Роглянемо детальніше цей процес.

 

 

 

 

Рис. 9.2. Регуляція експресії гену Mn-супероксиддисмутази.

 

Таким чином білок SoxR регулює експресію гену Mn-супероксиддисмутази опосередковано – через інший білок – SoxS. В цьому й полягає суть двоциклової регуляції.

Існує також одноциклова регуляція. Вона стосується впливу Н₂О₂ на захисні системи E. Сoli і здійснюється за допомогою білка OxyR. Аналогічно до SoxR, білок OxyR може перебувати у двох станах – відновленому та окисленому. Перехід із відновленої в окислену форму зумовлений взаємодією з пероксидом водню:

 

 

OxyR_ox зв’язується з промотором ефекторного гену і стимулює його експресію безпосередньо! В результаті суттєво зростає вміст гідроксипероксидази І, яка виявляє каталазну активність:

 

 

Однак існує спеціальна система, яка забезпечує відновлення окисленої форми OxyR. Встановлено, що білок OxyR окислюється за наступною схемою:

 

 

 

Рис. 9.3. Схема окислення OxyR.

 

Реакцію відновлення по залишках цистеїну каталізує тіоредоксин, при цьому він сам окислюється. Відновлення тіоредоксину відбувається за участю тіоредоксинредуктази, її коферментом є глутатіон. Відновлення глутатіону проходить під дією глутатіонредуктази, яка використовує як кофермент НАДН·H. Утворений окислений НАДФ⁺ відновлюється глюкозо 6-фосфатдегідрогеназою.

 

 

SoxR містить два 2-Fe-2-S-кластери:

 

			Fe2+ - ē → Fe3+

 

Механізм відновлення білка SoxR на сьогодні невідомий.

Розширюючи сучасні уявлення про оксидативний стрес слід зауважити існування речовин з подібними до АФК властивостями. Це активовані форми азоту і, зокрема, оксиду азоту (ІІ) ^·NO. Вперше виявлений як фактор, що розслаблює глакі м’язи серця. Встановлено, що ^·NO теж збільшує експресію гену SoxR. Білок SoxR під дією ^·NO отримує наступну конфігурацію:

 

Ефект, який викликає ^·NO приблизно той же, що і при дії АФК, однак принцип дії АФК інший:

 

 

Дослідження механізму індукції АФК експресії генів білків-антиоксидантів припадають на 90-і р.р. ХХ століття. Значною мірою до них долучився й автор. Коли стало відомо про стимуляцію експресії гену Mn-СОД супероксиданіон-радикалом, постало цікаве питання: а чи впливають інші АФК, зокрема, Н₂О₂ на ступінь транскрипції та трансляції вказаного гену чи активність відповідного білка. Для цього у дослідах Г.М. Семчишин під керівництвом автора було поставлено експеримент, в ході якого показано, що зростання концентрації Н₂О₂ супроводжується збільшенням Mn-СОД-активності. Отримані дані відразу ж наштовхнули на інше питання. Якщо пероксид водню здатний впливати на Mn-СОД-активність, то як саме: чи через активацію білка шляхом посттрансляційних модифікацій, чи через збільшення експресії гену Mn-СОД. Яким чином це перевірити? Існують два прості шляхи такої перевірки, вони й були використані. Перший – це блокування синтезу РНК під дією загальновідомого антибіотика левоміцетину з наступним вимірюванням ферментативної активності Mn-СОД. Другий, не менш знаний, пов’язаний з використанням дефектних генів, зокрема, гену OxyR. Співставлення результатів з використанням двох методів перевірки показали: 1) експресія Mn-СОД залежить від концентрації Н₂О₂; 2) стимулююча дія Н₂О₂ на Mn-СОД-активність опосередкована через OxyR. Такі висновки були зроблені, коли виявилося, що зростання концентрації Н₂О₂ в бактеріальній клітині супроводжується зниженням Mn-СОД-активності як при обробці левоміцетином, так і при інактивації гену білка OxyR.

3. Відповідь дріжджів на оксидативний стрес

Так склалося, що існує ще одна модельна система для вивчення процесів метаболізму АФК. Це – клітина дріжджів Saccharomyces cerevisiae. Але вивчати оксидативний стрес у дріжджів набагато складніше. Перша і відома всім причина цього – наявність ядра, адже дріжджі – це прості еукаріоти, які розмножуються, головним чином, шляхом брунькування. Разом з тим вкінці 90-х р.р. дріжджі стали типовим матеріалом досліджень відповіді еукаріотів на оксидативний стрес. Було виявлено, що активацію антиоксидантних ферментів – Mn, Zn-СОД та каталази – спричинює білок YAP1 (його функціональний аналог у клітинах вищих еукаріотів – АР1 – протоонкоген). Відновлена форма цього білка акумулюється в цитозолі і хоча YAP1 вільно проникає в ядро, існує спеціальний білок Сrm1, який зв’язує YAP1 на N-кінці і виводить його через пори. При цьому сам Сrm1 залишається в ядрі. АФК здатні окислювати білок YAP1. Окислена форма YAP1 накопичується в ядрі, бо вона пошкоджена в N-кінці, який зв’язується з Сrm1.

 

 

 

Рис. 9.4. Регуляція вмісту YAP1 у ядрі дріжджів за участю білка Сrm1.

 

Використання блокатора синтезу РНК циклогексиміду показало, що, як і в попередньому випадку, активація СОД здійснюється на рівні трансляції. Детально механізм цього процесу досліджений групою французьких вчених (Лаборе & Kº). Розпочали дослідження під робочою гіпотезою, побудованою аналогічно до такої в бактерій: Н₂О₂ викликає утворення SH-місточків восьми залишків цистеїну YAP1 (розташовані ближче до N-кінця). Однак окислення YAP1 відбувається значно складніше. Воно проходить в два етапи. Спершу маємо утворення дисульфідного містка між білком YAP1 і пероксидазою. Надалі утворюється дисульфідний мостик на YAP1 і окислена форма пероксидази. Остання відновлюється тіоредоксином за тим же принципом, що і при окисленні OxyR в E. сoli. Про те, що саме N-кінець відповідальний за зв’язування з Сrm1, дізналися при включенні YAP1 в плазміду з поступовим відщепленням ділянок, близьких до N-кінця. Інший метод, який використовувався – направлений мутагенез. Так стало відомо, що окислення YAP1 здійснюється по залишках цистеїну N-кінця.

При вивченні відповіді клітин на оксидативний стрес цікавим видається питання стосовно можливої різниці у сприйнятті клітиною тієї чи іншої АФК та формування адекватної реакції на збільшення її вмісту. На прикладі білка OxyR E. сoli було показано, що, дійсно, відповідь клітини залежить від природи оксиданту. Такий феномен виявлений і в еукаріотичних клітинах. Так, білок пекарських дріжджів YAP1 реагує на диетиламід по-іншому, ніж на типові оксиданти (АФК), викликаючи каскад специфічних реакцій. Використання циклогексеміду як блокуючого агента синтезу РНК у Saccharomyces cerevisiae показало,що білок YAP1 задіяний у відповіді на оксидативний стрес, який індукується ^·NO. Для визначення кількості YAP1, що експресується під впливом ^·NO, використовується наступний метод. Оскільки вказаний білок не має ферментативної активності, під промотор гену YAP1 включають кодуючупослідовність іншого білка, активність якого легко визначається за кількістю окисленого (відновленого) субстрату. Зокрема, в даному випадку використовували lacZ – ген β-галактозидази. Його хромогенний субстрат – о-нітрофеніл-β-D-галактозид легко визначається. Для того, щоб дізнатися, яка частина промотора YAP1 відповідає за регуляцію експресії, конструювали промотори з вирізнами ділянками. Серію таких промоторів запускали разом з геном lacZ і за активністюβ-галактозидази визначали ефективність їх роботи.

 

 

 

Рис. 9.5. Ферментативна активність β-галактозидази, експресованої різними промоторами.

 

Аналогічним чином можлива перевірка роботи будь-яких промоторів.