Занятие № 1

ТЕМА. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ФИЗИКО-ХИМИ-

ЧЕСКИЕ СВОЙСТВА БЕЛКОВ. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ

И ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

Цель занятия:

1.Повторить физико-химические и изучить биологические

свойства белков.

2.Ознакомиться с методикой выделения белков.

3.Усвоить принцип разделения белков на фракции методом

высаливания.

Исходный уровень знаний:

- кислоты и основания в органической химии;

- химические свойства карбоксильной группы;

- механизм нуклеофильного замещения у тригонального ато-ма углерода;

- химические свойства аминогруппы: основность и нуклео-

фильность;

- строение, амфотерность и растворимость аминокислот;

- коллоидные растворы и их свойства.

Содержание занятия.

I.2. Элементарный состав белков.

Классификация и номенклатура аминокислот, входящих в состав белков.

Функции белков.

Характерные физико-химические свойства белков.

Методы выделения и очистки белков.

 

II.1. Работа: ВЫСАЛИВАНИЕ БЕЛКОВ

Высаливание - это осаждение белков с помощью больших концентраций нейтральных солей: NaCl, (NH₄)₂ SO₄ и др.

Принцип метода.

Реакция высаливания обусловлена дегидратацией макромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется определенная концентрация одних и тех же солей. При высаливании белок обычно не теряет своих нативных свойств. Он может, например, вновь проявлять ферментативную активность. Метод высаливания позволяет получить белки в кристаллическом виде и разделить белковую смесь на фракции, а именно: белки сыворотки крови - на альбумины (А) и глобулины (Г). Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, высаливаются в полунасыщенном (50%), а альбумины - в насыщенном (100%) растворе сернокислого аммония.

Хлористый натрий осаждает глобулины при полном насыщении (100%) раствора, а для осаждения альбуминов требуется еще и его подкисление.

Высаливание белков является обратимой реакцией, т.к. осадок белка опять может раствориться после уменьшения концентрации солей диализом или разведением водой.

Для определения белка в растворе используется универсальная биуретовая реакция.

Химизм биуретовой реакции. Биуретовая реакция выявляет в белке пептидную (-CO-NH-) связь. В щелочной среде раствор белка при взаимодействии с ионами меди приобретает сине-фиолетовый цвет, а продукты его неполного гидролиза (пептоны) - розовое окрашивание. Биуретовую реакцию способны давать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей. Биуретовая реакция обусловлена образованием биуретового комплекса в результате соединения меди с пептидной группировкой белка. В щелочной среде лактимные формы образуются из лактамных форм. Биуретовая реакция схематично протекает так:

H R₂ O H R₄ O

| | || | | || Cu(OH)₂+2NaOH

H₂N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-C-N-CH-.....

| || | | || | |

R₁ O H R₃ O H R₅

полипептид (лактамная форма)

 

R₂ OH R₄ OH

| | | |

H₂N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH-C=N-CH-....

| | | | |

R₁ OH R₃ OH R₅

полипептид (лактимная форма)

 

Положительную биуретовую реакцию отдельные аминокислоты не дают. Исключение: гистидин и аспарагин, с которыми биуретовая реакция происходит при условии их больших концентраций в растворе.

R₂

|

R₁-HC-C=N-CH-C=N-CH-R₃

| | | |

H₂N O O C-ONa

||

Cu — ―N

↑ ¦

| R₄-CH

| | СOONa COONa

| C -ОNа | |

| || CH-NH₂ CH-NH₂

_{└ ― ― ― —} N | |

| CH₂ CH₂

CH-R₅ | N N

 

N Cu N

биуретовый медный комплекс медный комплекс с гистидином

фиолетового цвета в случае биуретовой реакции

 

ПРИМЕЧАНИЕ: при постановке биуретовой реакции нельзя добавлять избыток сульфата меди, так как синий осадок гидрата окиси меди маскирует фиолетовое окрашивание биуретового комплекса белка.

 

Порядок выполнения работы.

 

Реактивы	1 пробирка	2 пробирка
Раствор белка	20 кап.	20 кап.
Порошок NaCl	до полного насыщения	-
Насыщенный раствор (NH4)2SO4	-	20 кап.
ФИЛЬТРОВАНИЕ
Осадок	Глобулины	Глобулины
	К фильтрату 1 добавить
1% раствор CH3COOH	10-20 кап.	-
Порошок (NH4)2SO4	-	до полного насыщения
ФИЛЬТРОВАНИЕ
Осадок	Альбумины	Альбумины
КОНТРОЛЬ - БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ
Фильтрат 2	5 кап.	5 кап.
10% NaOH	5 кап.	5 кап.
1% CuSO4	1 кап.	1 кап.
РЕЗУЛЬТАТЫ:

ВЫВОД:

 

III.2.Контрольные вопросы.

Какие факторы удерживают белки в растворе?

Чем обусловлен коллоидный характер белковых растворов?

На чем основаны реакции осаждения белков?

Какие физико-химические свойства белков позволяют их

фракционировать?

Что такое высаливание?

С помощью какой реакции можно выявить белок

в растворе?

Какую окраску имеют белковые и безбелковые растворы

при проведении биуретовой реакции?

Какие отдельные аминокислоты могут дать

положительную биуретовую реакцию?

Чем отличаются альбумины и глобулины?

 

Материал для самоподготовки. I а)1. с.19-49, II, III.