Биологический метод

Биологический метод

В основе метода лежит экспериментальная инфекция на животных. В биологическом методе диагностики при воспроизведении экспериментальной инфекции могут быть изучены закономерности инфекционного процесса. Заражение экспериментальных животных может производиться с целью:

1) изучения вирулентности микробов;

2) воспроизведения и изучения инфекционного процесса;

3) испытания лечебного эффекта химиотерапевтических и иммунологических препаратов;

4) выделения чистой культуры возбудителя и ее идентификации.

В зависимости от цели исследования пользуются различными способами заражения: внутрикожным, подкожным, внутримышечным, внутрибрюшинным, внутривенным, пероральным или эндоназальным. Во всех случаях, за исключением перорального и эндоназального способов, заражение осуществляется с помощью шприца. Вскрытие трупов животных производится стерильными инструментами, соблюдая правила асептики. При вскрытии производят осмотр органов, осуществляют посев тканей и органов на питательные среды для бактериологического исследования, готовят мазки-отпечатки для обнаружения микроорганизмов, для изучения их вирулентных свойств (обнаружение капсулы). Для оценки степени вирулентности микробов определяют LD₅₀ (доза микробов, вызывающая гибель 50 % зараженных животных), а затем выделяют чистую культуру и изучают ее вирулентные свойства.

Изменения, обнаруженные при вскрытии трупа животного, а также результаты бактериологического исследования вносят в протокол вскрытия.

После гибели животного производится вскрытие трупа с целью обнаружения возбудителя путем микроскопического исследования мазков-отпечатков из органов и выделения чистой культуры:

· на специальную доску, покрытую ватой, смоченной дезинфицирующим раствором, помещают труп мышки вверх брюшком и фиксируют за лапки металлическими булавками;

· вскрытие трупа производят стерильными инструментами;

· проводят препаровку кожи от подлежащей ткани, вскрывают грудную полость, делают посев крови из сердца на кровяной агар и готовят мазок на предметном стекле;

· вскрывают брюшную полость, осматривают органы брюшной полости, проводят посев ткани печени и селезенки (при необходимости других органов и тканей) на кровяной агар и готовят мазки-отпечатки из этих органов на предметном стекле. Микропрепараты окрашивают, исследуют на обнаружение вирусов.

Помимо этого экспериментальные животные в вирусологии применяются для следующих целей:

· диагностики вирусных инфекций (выделение, накопление, типирование и титрование вирусов);

· получения иммунных противовирусных сывороток и ингредиентов крови (эритроцитов, лейкоцитов, плазмы и т.д.);

· моделирования вирусных инфекций для изучения патогенеза, иммунитета, патоморфологии и т.д.;

· разработки способов специфической и неспецифической профилактики и лечения.

Лабораторных животных используют главным образом для выделения вирусов, не вызывающих развития цитопатических изменений в культурах клеток и не размножающихся в куриных эмбрионах. Использование лабораторных животных позволяет также по клиническому симптомокомплексу идентифицировать характер вирусной инфекции, ставить реакцию нейтрализации, путем пассажей поддерживать лабораторные штаммы вирусов, сохранять антигенные свойства и активность вирусов, изучать в эксперименте течение вирусной инфекции и развитие иммунитета, получать диагностические и лечебно-профилактические вирусные препараты.

В качестве лабораторных животных, в зависимости от целей работ и вида исследуемых вирусов, чаще всего применяют белых мышей, хомяков, морских свинок, кроликов, реже – хорьков, кошек, собак. Из более крупных животных используют обезьян различных видов и некоторых других животных. Из птиц используют кур, гусей, уток. В последние годы чаще применяют новорожденных животных (более чувствительных к вирусам), «стерильных животных» (извлекают из матки и содержат в стерильных условиях с использованием стерильного воздуха и стерилизованного корма) и животных чистых линий с известной наследственностью (инбредные или линейные животные).

К лабораторным животным предъявляют весьма строгие требования. Животные должны быть в достаточной степени восприимчивы к инфекции данным вирусом и не нести в себе латентной инфекции и каких-либо паразитов. Имеют значение также вид животного, порода, возраст, масса, пол, упитанность, условия содержания. В опыт берут животных одного вида и возраста и содержат их в одинаковых условиях. Иногда используют разные виды животных, обладающих различной чувствительностью к одному и тому же вирусу, что помогает выявить разнообразные формы инфекции.

В эксперимент берут только здоровых животных, лучше из одного питомника и одной партии. Температуру тела измеряют в одно и то же время, т.к. имеются суточные колебания ее.

Для маркировки применяют следующие приемы метки лабораторных животных: маркировка красками – нанесение краски на различные участки тела животного, татуировка уха тушью, надрезы и насечки ушной раковины, обозначение нумерованными бирками и кольцами, ампутация пальцев.

Исследуемый материал вводят с учетом тропизма вирусов к определенным тканям. Так, для выделения нейротропных вирусов материал вводят в мозг, для выделения пневмотропных – через нос. Внутримозговое заражение новорожденных мышей лучше производить специальной тонкой иглой. Место инъекции середина расстояния между наружным слуховым проходом и наружным краем глаза. При внутрибрюшном заражении крыс или мышей держат головой вниз. Иглу вводят несколько в сторону от средней линии живота в средней его трети на глубину не более 0,5 см. При подкожном заражении иглу вводят под кожу в межлопаточном пространстве и продвигают к хвосту.

Кровь у мышей берут из сердца или после декапитации; у крыс – пункцией сердца или насечек на ушных раковинах или на хвосте; у морских свинок – из сердца, а также из насечек по краю уха, а у кроликов – путем надреза или прокола краевой вены уха. Если животных необходимо убить, то их умерщвляют хлороформом, эфиром или введением воздуха в вену. Приготовление взвесей тканей зараженных животных, обработку органов и другие манипуляции с вируссодержащим материалом проводят в боксах, которые систематически (не реже одного раза в неделю) обрабатывают 5 % раствором хлорамина или другим дезинфицирующим раствором.

Результаты выделения вируса считают положительными, если у животного после соответствующего инкубационного периода развиваются симптомы инфекции.