Методика определения общего числа микроорганизмов ОМЧ

(количества МАФАнМ) бактериологическим методом

 

Основные этапы определения ОМЧ (КМАФАнМ) бактериологическим методом:

§ гомогенизация образца,

§ десорбция микроорганизмов с плотных частиц,

§ приготовление разведений,

§ посев на питательные среды,

§ подсчет микробных колоний и идентификация выделенных культур.

Гомогенизацию образца проводят для равномерного распределения бактерий в анализируемом объекте. При исследовании проб различной консистенции, в зависимости от характеристик испытуемого материала, используют перемешивание простым встряхиванием или специальные приборы.

Десорбция бактерий с плотных частиц необходима для анализа объектов плотной консистенции. Для этого материал суспензируют в жидкости или с поверхности объекта берут смывы и отпечатки. При суспензировании к навеске образца массой 10 г (10 см³) добавляют 90 см³ воды и интенсивно перемешивают (вручную или в гомогенизаторе). В дальнейшем условно принимают 1 см³ полученной суспензии эквивалентным 0,1 г исходного материала.

Приготовление разведений чаще всего проводят, используя метод 10-кратных разведений, когда концентрация микроорганизмов каждого последующего разведения в 10 раз меньше предыдущего.

В стерильные пробирки с соблюдением правил асептики разливают по 9 см³ стерильной воды или специального раствора (физиологического раствора хлорида натрия, пептонной воды).

Из исследуемой пробы стерильной градуированной пипеткой отбирают 1 см³ жидкости (суспензии). Нельзя погружать пипетку в жидкость более чем на 3 мм во избежание в дальнейшем смывания микроорганизмов с ее наружной поверхности. 1 см³ жидкости (суспензии) переносят в пробирку с 9 см ³ жидкости для разведения. Получают разведение 1:10 (10^-1). Новой стерильной пипеткой(!) тщательно перемешивают содержимое пробирки путем многократного заполнения и опорожнения пипетки. Этой же пипеткой набирают 1 см³ исследуемой жидкости (суспензии) в разведении 1:10 и переносят во вторую пробирку с 9 см³ стерильной дистиллированной воды; получают разведение 1:100 (10^-2). Третьей стерильной пипеткой перемешивают содержимое второй пробирки и 1 см³ разведения вносят в третью пробирку с 9 см ³ жидкости для разведения; получают разведение 1:1000 (10^-3). Эти манипуляции повторяют до получения необходимого ряда разведений.

Рисунок 1

 

Посев на питательные среды проводят, используя методы глубинного и поверхностного посева.

а) Метод глубинного посева используют в случаях, когда идентификация микроорганизмов не требуется или же когда селекцию (выделение) той или иной группы микроорганизмов можно осуществить с помощью режима инкубации. В 2-3 и более пустые стерильные чашки Петри, соблюдая правила асептики, вносят по 1 см³ жидкой пробы, суспензии, а также приготовленного разведения. Чашки предварительно маркируют со стороны донышка, чтобы исключить их случайную замену при сдвиге. Не позднее чем через 15 мин после внесения материала в каждую чашку вливают по 10-12 см³ расплавленной и охлажденной до 45°С агаризованной питательной среды (МПА) так, чтобы толщина получившегося слоя была 4-5 мм. Вращательными движениями перемешивают расплавленную среду и посевной материал, чтобы микроорганизмы равномерно распределились в массе среды. Чашки Петри оставляют на рабочем столе 10-15 минут для застывания. После застывания среды чашки переворачивают вверх дном и помещают в термостат для инкубирования. Оптимальным является, как правило, термостатирование при 37⁰С в течение 24-48 ч. Затем приступают к подсчету колоний, выросших на поверхности и в глубине агара.