HHHH HHHM HHMM HMMM MMMMH4 H3M H2M2 HM3 M4 ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5. Поскольку H-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд, то изофермент H4 (ЛДГ1) будет мигрировать при электрофорезе с наибольшей скоростью к аноду. С наименьшей скоростью к аноду будет двигаться М4. Остальные изоферменты занимают промежуточное положение. Изоферменты ЛДГ локализованы в различных тканях: ЛДГ1,2 ----> мозг, аэробные ткани (миокард). ЛДГ3 ----> лейкозные клетки. ЛДГ4,5 ----> анэробные ткани: мышечная, скелетная. Изоферменты появляются на различных этапах онтогенеза и реализуют программу индивидуального развития. Изоферментный профиль меняется в процессе развития. При патологиях имеется существенный изоферментный сдвиг.
Изменение активности в онтогенезе. Онтогенез человека развивается по определенной генетической программе, которая записана на уровне ткани, всего организма в гипоталамусе. 1. Внутриутробный период. Характеризуется высокой активностью ферментов синтеза белка, липидов, происходит увеличение массы организма. Плод находится в анаэробных условиях и для метаболизма характерно анаэробная направленность. Основной источник энергии - жирные кислоты, поступающие из организма матери; ЖК также выполняют строительную функцию (фосфолипиды мембран). Глюкоза утилизируется анаэробным путем (анаэробный гликолиз), т. к. ткани плода не способны к ГНГ, и идет на развитие ЦНС. 2. Пренатальный период. Характеризуется изменением активности ферментов, происходит подготовка организма к пребыванию в аэробной среде. Изменяется спектр гемоглобина, уменьшается его сродство к кислороду, изменяется активность митохондриальных ферментов. 3. Грудной Потребность в глюкозе резко возрастает, она начинает утилизироваться аэробно, но примерно до двух лет основным источником энергии является все же липиды, причиной чего является соматотропин. (Гормон роста). 4. Ранний дошкольный период. С 3-х до 5-и лет. В этот период клетки начинают питаться углеводами. Происходит стабилизация обмена и интенсивная миелизация нервных волокон. 5. Школьный и пубертантный период. Обмен веществ модулируется под действием половых гормонов. 6. Зрелый. Происходит стабилизация массы тела, репродуктивного гомеостаза. После 35-40 лет основным источником энергии являются опять липиды, что связано с ослаблением чувствительности тканей к Гл и изменение гормонального фона: гиперстресс (увеличивается уровень гормонов) заставляет клетку работать на пределе, т. е. использовать в качестве энергии жиры.
Все ферменты и метаболические процессы компартментализованы (разделены и изолированы). В нормальной клетке находится более 1000 ферментов. Упорядоченное взаимодействие ферментов достигается путем многоуровневой регуляции и компартментализации. Зная локализацию ферментов в клетке и определяя их активность в крови, можно судить о степени деструкции ткани. Ядро: локализованы РНК-полимеразы, НАД-синтетаза, ферменты, участвующие в репликации ДНК. Митохондрии: ферменты тканевого дыхания, окислительного фосфорилирования, ферменты b-окисления ЖК, цикла Кребса, пируватдегидрогеназного комплекса, синтеза мочевины. Лизосомы: гидролитические ферменты с оптимумом рН в области 5 (пептидазы, эстеразы, нуклеазы). Рибосомы: ферменты белкового синтеза. ЭПС: ферменты синтеза липидов, ферменты гидроксилирования, детоксикации (метилирования, ацетилирования), конъюгации. Мембраны: Na-K-АТФаза, аденилатциклаза, ферменты транспорта субстратов. Цитоплазма: ферменты гликолиза, ПЦ, активации а/к, ферменты синтеза жирных кислот, ГНГ. Мультиферментные системы локализуются в структуре органелл таким образом, что каждый фермент располагается в непосредственной близости от следующего фермента данной последовательной реакции. Благодаря также компартментализации в клетке могут одновременно протекать 2 несовместимых процесса, например: b-окисление ЖК (в митохондриях) и синтез ЖК (в цитоплазме). Органоспецифические ферменты: Под органоспецифичностью понимают наличие метаболических путей, присущих только данному органу. Так вот органоспецифические ферменты - это ферменты, катализирующие определенные метаболические пути, присущие определенному органу. Хотя органы и имеют различное выражение того или иного метаболического пути, они имеют важное значение для диагностики многих заболеваний, путем определения их активности: так для печени характерна высокая активность АсАТ, АлАТ, сорбитдегидрогеназы, ГДГ. Причем активность АлАТ выше, чем АсАТ, т. к. АсАТ лучше спрятана во внутриклеточных структурах. Костная ткань - щелочная фосфатаза. Простата - кислая фосфатаза. Glandula parotis et pancreas - амилаза. Миокард - ЛДГ1 и ЛДГ2, креатинкиназа (ММ и MB-изоферменты). Мышцы - ЛДГ4,5; ММ. При нарушении целостности тканей этих органов, ферменты выделяются в сыворотку крови, где их активность резко повышается. В зависимости от того, активность какого фермента повысилась можно судить не только локализации каталитического процесса, но и о степени его тяжести. Но для более конкретной и точной диагностики заболеваний, для определения интенсивности и глубины повреждения тканей нужны маркерные ферменты. Это ферменты, принадлежащие определенной конкретной органелле: сукцинатдегидрогеназа - внутренняя мембрана митохондрий; кислые гидролазы - лизосомы; ферменты гликолиза - цитоплазма и т. д.
О скорости ферментативной реакции судят или по скорости убыли субстрата, или по скорости образования продукта. За единицу активности любого фермента (Е) принимается то количество фермента которое в оптимальных условиях катализирует превращение 1 мкмоля субстрата в 1 мин. Существует другая единица активности: 1 катал - количество фермента, который катализирует превращения 1 моля субстрата в 1 секунду. 1 Е фермента = 16,67 нкатал. Для выражения активности фермента пользуются определением удельной и молекулярной активности. Удельная активность - число Е ферментативной активности в расчете на 1 мг белка. Чем выше очистка фермента, тем выше удельная активность. Число оборотов фермента (молекулярная активность) - число молекул S,подвергающихся превращению одной молекулой фермента в 1 минуту. (Или число элементарных актов катализа, осуществляемой 1 молекулой фермента за 1 минуту). Число оборотов широко варьирует, например: 1. Карбоангидраза (катализирует перенос Н2СО3) совершает 36 000 000 оборотов. 2. Каталаза - 4000 оборотов. 3. Фосфоглюкомутаза - 1240 об/мин. Для качественного обнаружения и количественного определения активности сложных ферментов используют следующие методы: ЛДГ CH3 CH3 лактат -------- ПВК CH-ОН ------- С=О НАД НАД.Н+Н COOH COOH НАД.Н интенсивно поглощает свет (=340 нм). По изменению ПВК можно судить о НАДН. На одну молекулу лактата образуется одна молекула НАД.Н. НАД.Н интенсивно флюоресцирует. Интенсивность флюоресценции будет пропорциональна концентрации. В общем виде под активностью понимают количество фермента или биологического материла, содержащего фермент, которое при определенных условиях катализирует в единицу времени превращение определенного количества реагента, называемого субстратом. Активность - это изменение количества субстрата под влиянием фермента в единицу времени. Под изменением субстрата понимают снижающееся в единицу времени количество субстрата или же увеличивающееся количество продукта. Понятие "активность фермента" по сути дела идентична понятию "скорость ферментативной" реакции. Ферментативная активность выражается в единицах активности. В связи с существованием различных систем единиц исчисления введена интернациональная (стандартная) единица активности. Она носит символ "U" (unit-единица) и определяется как 1 мкмоль субстрата/мин. В системе СИ в качестве единицы ферментативной активности используют "катал" (kat). Катал определяется как 1 моль/сек. 1kat = 1 моль/сек. Размерность её слишком велика, на практике пользуются меньшими кратными значениями, начиная с нанокатала (нкат). Это одна миллиардная катала или 10-9 кат. В сравнении с международной единицей следующее уравнение 1 U = 16,67 нкат В практике лабораторий широко пользуются понятием удельная активность. Для этого число cтандартных единиц пересчитывают на какую-либо единицу сравнения. Это может быть мг белка в пробе или объем исследуемой биологической жидкости. Определение активности ферментов широко распространено в любой современной клинической лаборатории. При исследовании кинетики реакций используется и такое понятие как молекулярная активность. Она показывает, сколько молекул субстрата в секунду превращаются в продукт 1 молекулой фермента и используется для сравнительной характеристики активности нескольких ферментов. Пример вычисления активности фермента:
Если удельная активность, рассчитанная выше, относится к чистому химотрипсину, образец, давший, например, удельную активность 2.0 x 10-7 моль µг-1 мин-1 - 100 % x 2.0 x 10-7 / 3.2 x 10-6 или 6.3 % чистоты. 1.0 µг такого образца на самом деле содержит лишь 0.063 µг химотрипсина и 0.937 µг примесей.
Рис2-4. Молярное поглощение НАД+,НАДН+Н+, ФАД, ФАДН2 при разных длинах волн поглощаемого света Методы исследования активности определяются механизмом реакции и природой определяемого вещества. Наиболее широко используются: · Измерение изменения спектральных свойств (измерение поглощения света в видимой или ультрафиолетовой области, измерение флюоресценции) при помощи спектрофотометров, ФЭКов, спектрофлуориметров. Эти методы применяют и для определения количества продуктов или субстратов реакции, и для изменений количества коферментов, участвующих в реакции. Последнее нашло широкое применение в практике клинических биохимических лабораторий. В основе этих методов лежит закон Beer-Lambert: A = e x c x l = log (I0/I) (e, поглощение 1 M раствора вещества при специфической длине волны или молярный коэффициент экстинкции; c, концентрация; A, поглощение; l, длина в см кюветы спектрофотометра; I0, интенсивность падающего света; I, интенсивность прошедшего света). В случае, если молярный коэффициент экстинкции ( исследуемого вещества неизвестен, исследователь определяет экспериментально зависимость между поглощением света исследуемого раствора и концентрацией этого вещества и использует полученную закономерность в форме стандартного (калибровочного) графика. На рисунке 2-4 показаны спектральные характеристики коферментов НАД и ФАД в окисленной и восстановленной форме. Измерение поглощения при 340 нм используется для количественной оценки активности ферментов, катализирующих окислительно-восстановительные реакции c участием НАД. Вот пример такого расчета для реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой В этой реакции молочная кислота окисляется, передавая водороды на НАД+. При этом НАД+ восстанавливается до НАДН +Н+., который в отличие от НАД+ поглощает свет с длиной волны 340 нм. Допустим, за время проведения реакции поглощение при длине волны 340 нм изменялось на 0.31 единицы в минуту. Измерения проводили в кювете шириной 1 см. Коэффициент молярной экстинкции для НАДН при 340 нм e = 6200 л моль-1 см-1.
Эту величину можно использовать для оценки скорости реакции. · Измерение изменений концентрации высвобождаемых или поглощаемых во время реакции H+ или ОН- при помощи pH-стата (устройство, которое автоматически добавляет кислоту или основание, сохраняя постоянство pH в реагирующей смеси) · Химический анализ с использованием высокоразрешающей жидкостной или газовой хроматографии, или ЯМР или тонкослойной хроматографии. (АТФазы) · Изотопный анализ (например, с использованием радиоактивного 32P)
Сопряженные реакции – используются в случаях, если нет возможности прямо определить количество продукта исследуемой реакции. В таких случаях в реагирующую смесь добавляется фермент (Е2) катализирующий превращение образующегося продукта в реакции, которую можно оценить количественно, одним из вышеперечисленных методов. Если фермент Е2 присутствует в избытке, скорость образования C отражает скорость образования В. Например, сопряженное исследование активности глюкокиназы (используется избыток глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и НАДФ+) Глюкоза + AТФ → глюкоза 6-Ф + AДФ: (катализируется глюкокиназой –Е1) Скорость образования НАДФH (измеряется по поглощению при 340 нм) пропорциональна активности глюкокиназы (см выше)
В настоящее время известны и используются 3 вида классификации ферментов: 1. Тривиальная (исторически сложившаяся) номенклатура: (пепсин, трипсин). 2. Рациональная предложена французским физиологом П. Дюкло в 1883 году (к корню названия субстрата прибавляется суффикс - аза (липид - липаза, протеин - протеаза и т.д.). 3. Современная классификация рассмотрена и утверждена V Всемирным биохимическим конгрессом в г. Москве в 1961 г. В основу ее положен тип катализируемой реакции (всего 6 классов): 1) Оксидоредуктазы: катализируют окислительно-восстановительные реакции, лежащие в основе биологического окисления. Название дается по схеме: донор: «акцептор-оксидоредуктаза» ---> лактат: НАД-оксидоредуктаза. Различают аэробные дегидрогеназы или оксидазы, катализирующие перенос протонов (е) непосредственно на кислород; анаэробные дегидрогеназы ускоряющие перенос протонов (е) на промежуточный S, но не на кислород; цитохромы - катализируют перенос только е. Сюда также относятся каталаза и пероксидаза. 2) Трансферазы: ферменты, катализирующие перенос (внутри- и межмолекулярный) различных групп атомов. Название дается по форме: «донор - транспортируемая группа - трансфераза ---> метил-, формилтрансферазы, аминотрансферазы. Оба этих класса ферментов работают при участии коферментов, которые являются водорастворимыми витаминами: В6, В12, В1, В15. 3) Гидролазы: ферменты, катализирующие расщепление внутримолекулярных связей при участии молекулы воды. Название: «субстрат-гидролаза». К ним относятся все ферменты ЖКТ; в частности: эстеразы - гидролиз сложных эфиров; гликозидазы - гидролиз гликозидных связей углеводов; пептидгидролазы - гидролиз пептидных связей. 4) Лиазы - ферменты, расщепляющие C-C, C-N, C-O связи не гидролитическим путем с образованием двойной связи. Название: «субстрат-лиаза». Они обеспечивают отщепление CO2, H2O, NH3. Декарбоксилазы. 5) Изомеразы: ферменты, катализирующие различные типы реакций изомеризации. Сюда относятся рацемазы и эпимеразы. 6) Лигазы (синтетазы) - ферменты, катализирующие синтез органических веществ из 2-х исходных молекул с использованием энергии АТФ. Название: «X-Y-лигаза». X и Y - исходные вещества. Например: глутомат-аммиак-лигаза. Кроме всего этого все существующие ферменты (более 2000) имеют свой цифровой шифр, который присваивается по 4-х значному коду. Т. о. шифр каждого фермента состоит из 4-х цифр, разделенных точками и составляется по следующему принципу. Первая цифра указывает на номер одногоиз классов ферментов. Вторая цифра озночает подкласс, который характеризует тип связи, на которую действует фермент. Третья цифра означает подподкласс, который характеризует химическую природу донора или акцептора, участвующего в реакции. Четвертая цифра обозначает порядковый номер фермента. Алкогольдегидрогеназа (АДГ); КФ: 1. 1. 1. 1. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ); КФ: 1. 1. 1. 27.
|
