Задание 3. Описание культуральных свойств выделенной чистой культуры микроорганизмовОбъект исследования – чистая культура микроорганизмов – представителей микрофлоры кожи рук и слизистой глотки или сапрофитных микроорганизмов. Выполнить описание культуральных свойств выделенной чистой культуры микроорганизмов. Пересеять материал нескольких описанных изолированных колоний на скошенную поверхность питательного агара и в питательный бульон. Контрольные ВОПРОСЫ 1. Какие этапы исследования можно выделить при составлении видовой характеристики микроорганизма? 2. Какие признаки микроорганизмов являются основными при их идентификации? 3. Какие признаки включает морфологическая характеристика микроорганизмов? 4. Что такое культуральные свойства микроорганизмов? 5. Что такое колония микроорганизмов? Какие признаки изучают при описании колоний микроорганизмов? 6. Какие типы колоний образуются на плотных питательных средах? 7. Какой признак колоний необходимо изучать при помощи микроскопа? 8. По каким особенностям роста на жидких питательных средах можно судить об отношении вида к кислороду? 9. Какие особенности роста на жидких питательных средах указывают на морфологические признаки микроорганизмов? 3.2. Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов Цель занятия Знакомство с методами изучения физиологических и биохимических свойств микроорганизмов. Освоение приемов идентификации микроорганизмов. Основные сведения Характеристика физиолого-биохимических свойств включает описание их способности расти на разных питательных средах и вызывать определённые превращения веществ, входящих в состав этих сред. Учитывают использование различных соединений углерода, азота и серы, отношение к молекулярному кислороду, способность образовывать антибиотические вещества и проявлять ферментативную активность в отношении определённых субстратов. Физиологические особенности микроорганизмов Отношение к молекулярному кислороду. По отношению к молекулярному кислороду среди микроорганизмов выделяют группы облигатных аэробов и микроаэрофилов, факультативных и облигатных анаэробов. Чтобы судить об этих физиологических особенностях микроорганизмов, микробную суспензию высевают в пробирки с агаризованной средой уколом в столбик. Облигатные аэробы растут на поверхности среды и в верхнем слое (в виде «шляпки»), микроаэрофилы – на некотором расстоянии от поверхности. «Шляпку» на поверхности среды и слабый рост по уколу (рост в виде гвоздя) дают относительно аэробные формы. Факультативные анаэробы обычно развиваются по всей толще среды (по всей длине укола без «шляпки»); облигатные анаэробы растут только в глубине среды, у самого дна пробирки. Биохимические свойства микроорганизмов Биохимические свойства микроорганизмов изучают по характеру и количеству тех ферментов, которые микробная клетка продуцирует и выделяет в окружающую среду. Исследование биохимических свойств прокариот является обязательным при определении их видовой принадлежности, при этом наибольшее значение имеет определение протеолитических и сахаролитических ферментов, активирующих соответственно расщепление белков и углеводов. Определение сахаролитических ферментов. Прокариоты характеризуются неодинаковой способностью использовать в метаболизме различные соединения углерода. Чтобы выяснить такие особенности, микроорганизмы высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды (среды Гисса или так называемый «пестрый ряд»). Рост микроорганизмов на таких средах часто сопровождается накоплением органических кислот и газов, что регистрируют по изменению рН среды. Для этого в среды добавляют индикаторы (чаще бромтимоловый синий) из расчета 2 мл 1, 6 % спиртового раствора на 1 литр среды. Среды засевают суспензией клеток микроорганизмов и термостатируют 1–5 суток. Рост на среде с данным источником углерода определяют по помутнению среды, образованию пленки или осадка, изменению цвета питательной среды, которое указывает на образование кислых или щелочных продуктов метаболизма. Об образовании газа свидетельствует его накопление в поплавке (при посеве в жидкую среду) или разрывы в агаризованной среде. Для обнаружения фермента лактазы (расщепляющего молочный сахар – лактозу) используют плотные дифференциально-диагностические среды (Эндо, Плоскирева), содержащие лактозу и индикатор. Бактерии, способные сбраживать лактозу, дают на среде окрашенные колонии, вследствие изменения рН среды. Для выявления амилолитической активности используют среду содержащую растворимый крахмал, в которую исследуемые микроорганизмы высевают штрихом по диаметру чашки или уколом. Гидролиз крахмала обнаруживают после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивается в синий цвет, а зона гидролиза остается бесцветной или приобретает красно-бурую окраску, если крахмал гидролизовался до декстринов. Определение протеолитических ферментов. Некоторые микроорганизмы способны продуцировать протеолитические ферменты – протеазы, катализирующие расщепление белков. Расщепление белка сопровождается выделением индола, аммиака и сероводорода. Протеолитические ферменты (протеазы) катализируют расщепление белков на поли- и олигопептиды. Протеазы выделяются различными видами бацилл, актиномицетов, мицелиальных грибов и другими микроорганизмами. Активность внеклеточных протеаз определяют, используя в качестве субстрата желатину, казеин и другие белки. Кроме того, различия роста микроорганизмов по уколу в мясо-пептонную желатину определяются их отношением к молекулярному кислороду. Определение сероводорода при расщеплении белка проводят в пробирке с мясо-пептонным бульоном ил 2 % пептонным бульоном, закладывая под пробку полоску фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При образовании сероводорода полоска чернеет от образующегося сульфата свинца. Выделение индола определяют по окрашиванию полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором щавелевой кислоты, в розовый цвет. Присутствие аммиака обнаруживается по щелочной реакции влажной универсальной индикаторной бумаги, также помещенной под пробку пробирки. Определение способности к брожению проводят обычно на углеводно-пептонной среде с относительно высокой концентрацией углеводов. Посев делают уколом, после чего поверхность среды в одной пробирке заливают расплавленным парафином или смесью вазелинового масла и парафина (1: 1) слоем 1–2 см. По окончании опыта регистрируют изменения рН среды по перемене цвета индикатора и газообразованию. Микроорганизмы, способные сбраживать углеводы, растут и образуют кислоты в обеих пробирках, но кислотность в анаэробных условиях значительно выше, чем в первом варианте. Это хорошо заметно по изменению цвета индикатора. Если брожение сопровождается образованием газов, то происходит разрыв агаризованной среды. Для изучения способности микроорганизмов к брожению используют дифференциально-диагностические среды, содержащие один или несколько углеводов, мочевину, соли железа и др. (среды Ресселя, Гисса, Олькеницкого и т.д.) В настоящее время широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). Они представляют собой диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами субстрата в сочетании с индикатором. СИБы опускают в пробирку с бульонной культурой исследуемых микроорганизмов и по изменению цвета диска с субстратом судят о наличии фермента. Микротест-системы представляют собой одноразовые пластиковые контейнеры со средами, содержащими различные субстраты с добавлением индикаторов. В них производят посев чистых культур исследуемых микроорганизмов, термостатируют и также по изменению цвета судят о наличии ферментов. Содержание лабораторной работы
|
