Метод иммуноблотаМетод иммуноблоттинга (первоначальное название Western blot, WB1) был разработан главным образом в целях обнаружения в сыворотках пациентов антител, реагирующих с отдельными белками возбудителей инфекционных заболеваний, чаще всего вирусов. Метод представляет собой следующее. 1. В культурах клеток in vitro (в настоящее время, как правило, в промышленных масштабах) выращивают препаративные количества реплицирующихся вирусов. 2. Клетки разрушают (ультразвуком или иначе), вирусную массу выделяют из культуральной смеси методами ультрацентрифугирования. 3. Вирусные частицы диссоциируют на отдельные белки детергентами и подвергают электрофорезу в геле. В результате каждый вирусный белок в соответствии со своей молекулярной массой и электрическим зарядом занимает определенную позицию в геле. Без применения красок и специальных проявляющих реагентов фракционированные электрофорезом белки в геле не видимы глазу. 1 Впервые блестящая методическая идея «блоттинга» (переноса на «промокашку»; blot по-английски - пятно на промокашке) пришла в голову и была реализована применительно к электрофоретическому анализу ДНК биохимиком E.M. Southern в 1975 г. Из уважения к автору коллеги-биохимики воспользовались лингвистической особенностью фамилии Southern (южный) и тот же метод, примененный к РНК, назвали Northern blot (северный), а к белкам - Western blot (западный). 4. В целях существенной экономии дорогостоящих реагентов в дальнейшем фракционированные белки из геля «промокают», перенося таким образом на плоский пористый материал - нитроцеллюлозу. В производственных масштабах перенос продуктов электрофоретического разделения в геле на нитроцеллюлозу осуществляют также электрофорезом. 5. Лист нитроцеллюлозы с перенесенными на нее электрофоретически разделенными белками вируса нарезают на тонкие полоскистрипы (strip), соответствующие по формату специальным выпускаемым промышленностью пластмассовым «корытцам», в которых стрипы обрабатывают испытуемыми сыворотками и проявляющими реагентами. 6. Стрип заливают испытуемой неразведенной и разведенной 1: 10 (или подбирают иные разведения) сывороткой, инкубируют 1 ч или более, тщательно промывают фосфатным солевым буфером с детергентом (0, 1% Tween-20), заливают раствором конъюгата антииммуноглобулиновых антител с ферментом (например, пероксидазой хрена), инкубируют 1 ч, тщательно промывают, вносят раствор субстрата (например, ортофенилендиамина с перекисью водорода), после чего наблюдают, не проявятся ли окрашенные полосы в зонах расположения фракционированных вирусных белков. В случае, если у человека в крови нет противовирусных антител, стрип остается неокрашенным (имеет место лишь неспецифический легкий фон по всей площади стрипа). Это отрицательный результат. Если окрашенными оказываются все полосы вирусных белков, результат квалифицируют как положительный. Если окрашиваются не все, а 1-2 полосы, результат рассматривают как неопределенный. Ложноотрицательные результаты в иммуноблоте крайне маловероятны. Поэтому по международным соглашениям сертифицированные для клинической диагностики промышленно выпускаемые иммуноблоттинговые тест-системы приняты в качестве подтверждающих по отношению к планшетным и прочим скрининговым иммуноанализам. На рис. 4.11. представлена схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга.
|
Рис. 4.11. Схема «сэндвича», приготовленного для блоттинга
