По методу Лоури

 

Цель работы: освоение количественного определения белковых веществ методом Лоури в растительном и животном сырье.

 

Оборудование, реактивы и материалы: технические весы, фотоэлектроколориметр, кюветы шириной 1 см, фарфоровые ступки, мерные колбы вместимостью 100 см³, пробирки, мерные пипетки вместимостью 1 см³, градуированные пипетки вместимостью 1 см³, центрифуга, сухие бумажные фильтры, воронки; реактив А (2 г карбоната натрия растворяют в 100 см³ раствора гидроксида натрия с концентрацией 0, 1 моль/дм³), реактив Б (0, 5 г раствора цитрата натрия или виннокислого натрия-калия с массовой долей 1 %), реактив В (смешивают непосредственно перед анализом 1 см³ реактива Б с 50 см³ реактива А), раствор альбумина с массовой долей 0, 025 %; реактив Фолина-Чокальтеу (в мерную колбу вместимостью 1 дм³ вносят 50 г вольфрамата натрия, 12, 5 г молибдата натрия и 350 см³ дистиллированной воды, раствор охлаждают и добавляют 25 см³ раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 85 % и 50 см³ концентрированной соляной кислоты; осторожно кипятят с обратным холодильником в течение 10 ч. Затем вносят 75 г сульфата лития, 25 см³ дистиллированной воды, 2-3 капли брома и вновь нагревают под тягой без обратного холодильника в течение 15 мин; полученный раствор должен быть ярко-желтого цвета и прозрачным; при появлении зеленоватого оттенка обработку бромом повторяют; полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм³ и доводят объем до метки раствором гидроксида натрия с концентрацией 0, 10 моль/дм³.; проверяют молярную концентрацию полученного раствора по кислоте (концентрация раствора должна быть 1 моль/дм³); раствор яичного белка с массовой долей 10 %, прессованные дрожжи (10 г дрожжей растирают с кварцевым песком, добавляют 10 см³ дистиллированной воды и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см³, фильтруют через бумажный фильтр или центрифугируют), раствор казеина с массовой долей 10 %.

 

Теоретические сведения

 

Белки в щелочной среде образуют с раствором сульфата меди окрашенные растворы вследствие образования биуретового комплекса. В формировании окраски при определении содержания белков методом Лоури участвуют также окрашенные комплексы, образующиеся в процессе реакции Фолина на терозин, триптофан и цистеин.

 

Ход работы

 

В мерную колбу, вместимостью 100 см³, вносят 10 см³ приготовленного раствора или вытяжки исследуемого продукта (яичного белка, дрожжей или казеина), доводят до метки дистиллированной водой. В пробирку отбирают 0, 4 см³ разбавленного раствора для анализа, добавляют 2 см³ реактива В, перемешивают и выдерживают при темпепературе (20±1) °С в течение 10 мин. Затем вносят 0, 2 см³ реактива Фолина-Чокальтеу, перемешивают и через 30 мин измеряют оптическую плотность при 500 или 750 нм на фотоэлектроколориметре с соответствующим светофильтром против контрольной пробы.

Контрольную пробу готовят аналогично, только заменяют исследуемый раствор дистиллированной водой в объеме 0, 4 см³.

Для построения градуировочного графика в 5 пробирок вносят соответственно 0, 05; 0, 1; 0, 2; 0, 3 и 0, 4 см³ раствора альбумина с массовой долей 0, 025 %. Первые четыре пробирки доливают дистиллированной водой до 0, 4 см³. В дальнейшем анализ проводят как и для исследуемых образцов. После фотоколориметрирования полученные значения оптической плотности откладывают на оси ординат, а концентрации альбумина на оси абсцисс (l, 25× 10⁵; 2, 5× 10⁵; 5, 0× 10⁵; 7, 5× 10⁵ и 10, 0× 10⁵ г белка).

С помощью градуировочного графика устанавливают содержание белка в исследуемом образце.

 

Оформление результатов

Значения содержания белка в исследуемых продуктах, определенных с помощью метода Лоури, вносят в таблицу.

 

Наименование продукта	Содержание белка
Яичный белок Прессованные дрожжи Казеин

 

Контрольные вопросы и задания

 

1. На чем основан метод Лоури?

2. Напишите уравнение биуретовой реакции. Протекает ли эта реакция в ходе определения концентрации белка по методу Лоури?

3. С какой целью вносят реактив Фолина?

 

Лабораторная работа № 13