Ход работы. Реактивы 2,3,4 содержат готовые к использованию реагенты

Реактивы 2, 3, 4 содержат готовые к использованию реагенты. Хранить при t – 2-8⁰С.

Содержимое пакета с натрием едким количественно перенести в колбу вместимостью 1л, растворить и довести до метки дистиллированной водой, свободной от карбонатов. Хранить при комнатной температуре.

А. Приготовление опытной пробы. В пробирку вносят 0, 25 мл субстратного раствора для определения АсАТ (или АлАТ), нагревают при 37⁰С в течение 5 минут, добавляют 0, 05 мл сыворотки крови, инкубируют при 37⁰С 60 минут. Затем добавляют 0, 25 мл 2, 4-ДНФГ и выдерживают 20 минут при комнатной температуре. Добавляют 2, 5 мл 0, 4М раствора натрия едкого, перемешивают и через 10 минут фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против холостой пробы.

Б. Приготовление холостой пробы. Эту пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови добавляют 0, 05 мл физиологического раствора.

Расчет активности ферментов в сыворотке крови производят по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика

В пробирки вносят растворы в соответствии с таблицей, затем в каждую пробирку добавляют по 0, 5 мл 2, 4-ДНФГ, тщательно перемешивают и через 20 минут (18-25⁰С) вносят по 0, 5 мл 0, 4н NaOH.

 

№ п/п	Стандартный р-р пирувата натрия	Физиологич. раствор	Субстратный раствор АлАТ/АсАТ	Активность фермента (АсАТ, АлАТ)
мл	мл	мл	ммоль/(ч*л)	мккат/л
	0, 05	0, 1	0, 45	1, 0	0, 28
	0, 1	0, 1	0, 40	2, 0	0, 56
	0, 15	0, 1	0, 35	3, 0	0, 83
	0, 2	0, 1	0, 30	4, 0	1, 11
	0, 25	0, 1	0, 25	5, 0	1, 39
контроль	–	0, 1	0, 50

 

Инкубирую при комнатной температуре 10 минут и затем фотометрируют при длине волны 500-560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10мм против контроля. На оси координат откладывают найденную величину оптической плотности, на оси абсцисс – активность фермента в ммоль/ч*л или в мккат/л («ммоль/ч*л» соответствует 0, 278 «мккат/л»).

Калибровочная кривая до величины оптической плотности 0, 3. При более высоких значениях оптической плотности сыворотку крови необходимо развести и повторить анализ. При расчете активности учесть степень разведения сыворотки (пропорциональность между степенью разведения и активностью фермента в разведенной сыворотке наблюдается не всегда).

 

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (активность фермента, моль/ч*л) и сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин.

 

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют и к какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?

2. Почему АлАТ и АсАТ называют индикаторными ферментами?

3. Назовите нормальные величины активности исследованных Вами ферментов?