Модельные мембранные системы. Использование липосом для транспорта лекарственных веществ.

Основные мембранообразующие липиды представляют собой соединения с идеальным сочетанием гидрофобных и гидрофильных свойств. Они сравнительно плохо растворимы в воде в мономерном виде, а стремление их полярных головок максимально контактировать с водой придаёт им уникальные способности образовывать многообразные сравнительно устойчивые структуры при агрегации этих молекул

1. Модель – монослой липидов на границе раздела вода – воздух или вода – масло. Гидрофильные головки находятся в воде, а гидрофобные хвосты – в воздухе или в масле. Если постепенно уменьшать площадь, занимающую монослоем, то удается получить монослои, в 2 молекулы расположены так же плотно, как и в одном из монослоев мембраны. При изменении состояния липидных молекул (под действием температуры, лекарственных препаратов) меняется площадь, занимаемая молекулами. Поэтому в биологических и медицинских исследованиях широко используются монослои синтетических липидов, изолированных из различных природных мембран.

2. Бислойная липидная мембрана – создана Мюллером в 1962г. Заполнили отверстие в тефлоновой перегородке, разделяющей 2 водных раствора, фосфолипидном, растворенным в гептане. После того, как растворитель и излишки липида растекаются по тефлону, в отверстии образуется бислой толщиной несколько мм. и диаметром приблизительно 1мм: Расположив по обе стороны мембраны 2 электрода, можно измерить сопротивление мембраны или генерируемый на ней потенциал. Если по разные стороны перегородки поместить различные по химическому составу растворы, то можно изучить проницаемость мембраны для различных агентов, а так же лекарственных препаратов.

 

 

3. Липосомы – это мельчайшие пузырьки (везикулы), состоящие из билипидной мембраны и полученные обработкой ультразвуком смеси воды и фосфолипидов малые одноламелярные везикулы. Липосомы фактически являются биологической мембранной, полностью лишенной белковых молекул:

В медицине липосомы используют для доставки лекарственных веществ в однораздельные органы и ткани, приготавливая их в среде, содержащей нужное вещество. Липосомы не токсичны, полностью усваиваются в организме и являются надежной липидной микрокапсулой для направленной доставки лекарств. Они встраиваются именно в те органы которые нуждаются в лечении, что позволяет проводить целенаправленную терапию на клеточном уровне, например путем вкл. в липосому специф. антител к мембранным белкам клеток-мишеней. Без таких мер липосомы концентрируются в печени и селезенке. Используя это их свойство можно без потерь доставлять липосомы в печень и селезенку, откуда лек. в-ва будут транспортироваться. Липосомы обладают очень малой проницаемостью для ионов и большинства полярных молекул.

Большие многослойные липосомы – липиды растворяют в органическом растворителе (бензол, хлороформ) и полученный раствор упаривают в вакууме в роторном испарителе. Липиды остаются на стенках колбы в виде пленки. В колбу с пленкой + водный буферный раствор и встряхивают его. Полученные липосомы выдерживают в водной среде в течение нескольких часов для установления равновесия.

1. + белок – часть липосом разрушается с образованием липопротеиновых комплексов.

2. липопротеиновые комплексы адсорбируются на поверхности оставшихся интактными липосом.

3. липиды комплексов сливаются с липидами липосомальной мембраны.

Протеолипосомы встраиваются не во все клетки организма, а именно в те, которые нуждаются в лечении.

 

19. Электронная микроскопия в исследовании биологических мембран. Устройство электронного микроскопа. Метод замораживания – скалывания, замораживания – травления.

В зависимости от вида электронных линз:1). Магнитные.2). Электростатические.3). Комбинированные.

По характеру исследования:1). Просвечивающие.2). Отражательные.3). Эмиссионные.4). Растровые.5). Зеркальные.

Наиболее распространенным является электромагнитный микроскоп просвечивающего типа.

Основным источником информации о строении клеток и клеточных мембран служит электронная микроскопия.

Обычный оптический микроскоп состоит из источника света, конденсатора, фокусирующего свет на объекте, держателя (т.е. предметного стекла и столика), объектива для фокусирования изображения и окуляра для проекции изображения, которое дает объектив в глаз наблюдателя. Эта же схема действует и в электронном микроскопе, за исключением того, что свет заменён пучком электронов, вместо держателя образца имеется проволочная сетка и вместо стеклянных линз используются электромагнитные.

В основе электронной линзы лежит электромагнит с осевой симметрией, через него проходит электронный пучок. Магнитное поле генерируется обмоткой из медной проволоки. Для получения большого увеличения линзы имеют короткое фокусное расстояние. Фокусное расстояние уменьшается с увеличением напряжённости магнитного поля. Напряжённость магнитного поля можно увеличить, усиливая ток в обмотке, однако это сопровождается выделением большого количества тепла. Поэтому прибегают к концентрированию поля путем помещения обмотки в кожух из мягкого железа и введения двух конических элементов из мягкого железа, которые называются полюсными наконечниками, причём каждый из них имеет небольшой канал, через который проходит пучок. Расходящийся пучок электронов можно сфокусировать в определённых пределах в точку на оси линзы.

Источником излучения служит раскаленная добела вольфрамовая спираль, которая испускает электроны. Потенциал анода, к которому движутся электроны, обычно на 40-100 кВ больше потенциала спирали. Спираль и анод вместе составляют электронную пушку. Анод имеет небольшой канал, через который проходят наиболее быстрые электроны. Это канал вместе с маленькой апертурой сжимает поток электронов, давая на выходе узкий электронный пучок. Этот пучок несколько расходится, поскольку электроны на выходе из канала отклоняются за счет положительного потенциала анода. Расходящийся пучок фокусируется на образце с помощью электромагнитной линзы – конденсатора.

Изображение образуется за счёт так называемого вычитающего действия образца. Оно заключается в рассеянии некоторых электронов атомами объекта. Распределение этой потери электронов приводит к получению изображения. Линза объектива, отрегулированная так, чтобы образец находился точно в фокусной точке, вновь фокусирует пучок с образованием изображения. Это изображение затем увеличивается в несколько стадий тремя электромагнитными линзами, которые называются дифракционная, промежуточная и проекционная. Третья, проекционная линза и даёт изображение либо на флуоресцентном экране, либо на фотопластинке.

Таким образом, электронный микроскоп позволяет реально получить приблизительно в 500 раз более высокое разрешение, чем оптический микроскоп.

Замораживание – травления – метод приготовления материала для электронной микроскопии, включает замораживание свежей или фиксированной ткани во фреоне или жидком азоте и изготовление срезов в условиях вакуума, при котором происходит частичная сублимация воды из ткани и на ее поверхности проступает рельеф. С такой правленой поверхности получают отпечатки и исследуют их под электронным микроскопом (3 – х. мерное изображение).

Замораживание – скалывание – включает в себя замораживание клеток при температуре жидкого азота (- 196 C) и скалывание образовавшегося кубика льда. Открывающиеся поверхности сколов отмечают платиной и углеродом, органическое вещество удаляется и получатся платиновая решетка, которую рассматривают в электронный микроскоп.