Последовательности (сигналы) ядерной локализации.

 

История изучения аминокислотных последова­тельностей ядерной локализации (ПЯЛ) насчитывает примерно 20 лет. Впервые в 1984 г. опытами Кальдерона и др. была обнаружена первая ПЯЛ, принадлежащая белку вируса SV40 – большому ядерному Т-антигену (Т от англ. tumour – опухолевый), который синтезиру­ется в зараженной клетке вскоре после проникновения в нее вируса; он нужен вирусу, чтобы эффективно ис­пользовать ядерный аппарат клетки для собственной репликации. Этот белок, как оказалось, содержит ПЯЛ из семи аминокислот начиная со 124-й аминокислоты с N-конца большого Т-антигена: пролина¹²⁴-лизин-лизин-лизин-аргинин-лизин-валин. Утрата этого участка или замена лизина¹²⁶ на треонин¹²⁶ драматически ска­зывается на внутриклеточной локализации измененного таким образом белка: введенный в цитоплазму белок с одной-единственной заменой лизина¹²⁶ на тре­онин¹²⁶ вместо того, чтобы накапливаться в ядре, как это делает нормальный Т-антиген, продолжает оста­ваться в цитоплазме.

Вслед за этим открытием последовал всплеск ис­следований и находок аналогичных и других ПЯЛ раз­личных клеточных и вирусных белков. Казалось, пони­мание процесса транспорта белков в ядро почти достигнуто. Однако все лаборатории, изучавшие про­цессы цитоплазменно-ядерного транспорта, столкнулись со странным фактом.

Часто кинетику этого про­цесса исследуют с помощью лазерной сканирующей микроскопии. Для того чтобы охарактеризовать транспорт лю­бым из этих способов, нужно в клетку ввести флуоресцентно меченный исследуемый белок. Белок вводят в клетку либо путем микроинъекции (инъекции с помо­щью микрокапилляра), либо клетку "перфорируют". Последнее делают так: на слой клеток накладывают подсыхающий фильтр, в капилляры которого по мере испарения воды затягиваются клеточные микровор­синки, затем фильтр снимают, отрывая микроворсин­ки и оставляя отверстия в плазматической мембране. Эти отверстия по прошествии 10-15 мин затягивают­ся, но этого времени достаточно, чтобы добавленный к клеткам раствор изучаемого меченого белка смог войти через отверстия в цитоплазму.

Казалось бы, оба метода введения флуоресцентно меченного белка должны были давать одинаковые ре­зультаты, однако если после микроинъекции практи­чески всегда можно было наблюдать транспорт ядерно­го белка из цитоплазмы в ядро, то точно такой же белок, доставленный в цитоплазму таких же клеток ме­тодом "перфорации", нередко оставался в цитоплазме и не перемещался в ядро. Этот парадокс довольно дол­го не могли разрешить: в самом деле, если транспорт осуществляется через поровый комплекс и структуры, опознающие ПЯЛ белков, расположены в этом ком­плексе (как считали на тот период), то что же может препятство­вать ядерному белку, оказавшемуся в цитоплазме клет­ки – пусть перфорированной, но с целым поровым комплексом (это можно подтвердить электронной микроскопией), переместиться в ядро. Возникла мысль, что через отверстия, возникшие при "перфорации", какие-то цитозольные факторы выходят из клетки. Действительно, введение клеточного цитозоля в раст­вор вводимого меченого белка полностью восстанав­ливало транспорт этого белка в ядро. Но каково же бы­ло удивление исследователей, когда выяснилось, что то, что в цитозоле обеспечивает восстановление ядерно­го транспорта, оказалось теми рецептивными белками, которые узнают, то есть связывают ПЯЛ, и существова­ние которых предполагалось на поровом комплексе, но никак не вдали от него – в цитозоле. Эти белки назвали импортинами (другое название – кариоферины).

Одновременно с ними был обнаружен также непоровый небольшой белок Ran, обладающий свойствами ГТФазы (то есть фермента, гидролизующего ГТФ) и участвующий в транспорте белков с ПЯЛ. Как и все ма­лые ГТФазы, Ran существует в комплексе либо с ГТФ, либо с ГДФ. Из-за того, что в цитозоле находится белок RanGAP1 (белок, ак­тивирующий Ran ГТФазу, то есть активирующий гидролиз ГТФ до ГДФ), а в ядре – RanGEF (фактор обмена ГДФ у Ran, то есть способствующий обмену ГДФ на ГТФ у белка Ran), то в результате их действия существует очень неравномер­ное распределение двух форм Ran по обе стороны ядер­ной мембраны: в ядре находится преимущественно Ran ГТФ, а в цитоплазме – Ran ГДФ (рис. 4).

 

 

 

Схематически транспорт белков с последовательностей ядерной локализации, подобны­ми описанному большому Т-антигену вируса SV40 (та­кие ПЯЛ называют классическими), представлен на рис. 5. Весь процесс может быть разделен на два этапа:

Ø первый состоит из связывания белка с последовательностью ядерной локализации в цитозоле со своего рода рецептором – комплексом α-импортина с β-импортином и последующего "причаливания" все­го тримера к Nup-белкам порового комплекса, имею­щим FG-повторы, которые и служат своего рода местом "зачаливания" всех цитозольных участников транс­порта.

Ø второй этап начинается с подклю­чения RanГДФ и некоторых других белков к процессу транспорта, в резуль­тате чего комплекс переносимого белка с рецептором оказывается в ядре. Затем с комплексом, точнее, с β-импортином взаимодействует RanГТФ, в результате чего переносимый белок отделяется от α-импортина, а β-импортин в комплексе с RanГТФ возвращается в цитоплазму, где RanГТФ опять переходит в RanГДФ под влиянием RanGAP1.

 

Обратный процесс – экспорт из ядра происходит по сходному сценарию. Для того чтобы большой белок смог выйти из ядра, он должен иметь особую амино­кислотную последовательность экспорта из ядра (ПЭЯ), например лейцинсодержащую ПЭЯ, как у ингибитора цАМФ-зависимой протеинкиназы: лейцин-аланин-лейцин-лизин-лейцин-аланин-глицин-лейцин-аспар-тат-изолейцин. Такой сигнал, ПЭЯ, "узнается" – свя­зывается особым рецепторным белком – экспортином и с помощью RanГТФ переносится через поровый ком­плекс в цитоплазму, где переносимый белок под дейст­вием RanГДФ диссоциирует из комплекса. Для тРНК существует "свой" экспортин-т, связывающийся с ней непосредственно, тогда как мРНК переносится с осо­бым комплексом, включающим другой экспортин – экспортин-1.

Интересную группу сигналов составляют так назы­ваемые челночные сигналы или последовательности, позволяющие их носителям курсировать из цитоплаз­мы в ядро и обратно. Нужно отметить, что существует много типов ПЯЛ, ПЯЭ и челночных сигналов, здесь приведены только отдельные их примеры.

Процесс транспорта в ядро может регулироваться, иными словами, не все в транспорте белка диктует та аминокислотная сигнальная последовательность, ко­торая на нем записана. При исследовании кинетики транспорта белков в ядро методами лазерной конфо­кальной сканирующей микроскопии или восстановле­ния флуоресценции оказа­лось, что важное значение имеют расположенные невдалеке от ПЯЛ участки белка. Так, было установлено, что ближе к N-концу белка расположены два участка, узнаваемые двумя разными протеинкиназами (ферментами, фосфорилирующими белки, то есть пе­реносящими остаток фосфорной кислоты от АТФ на такие аминокислотные остатки белка, как серин, треонин, тирозин): протеинкиназой СК2 и циклинзависимой протеинкиназой cdc2 (рис. 6). Выяснилось, что фосфорилирование серинов (¹¹¹серин-¹¹²серин) приво­дит к увеличению скорости доставки белка с этими последовательностями ядерной локализации в ядро (примерно в 50 раз); это было обусловлено увеличением сродства такого белка к α-импортину. А фосфо­рилирование ¹²⁴треонина влекло за собой уменьшение скорости транспорта этого белка в ядро, обусловленно­го, по-видимому, тем, что аминокислоты, составляющие ПЯЛ, оказывались пространственно недоступными, закрытыми для α-импортина.