Лабораторна робота № 2РЕАКЦІЇ ОСАДЖЕННЯ БІЛКІВ
Мета роботи - практичне вивчення властивостей білків, а саме: їх розчинності. При виконанні лабораторної роботи студенти повинні набути навички та уміння проведення експериментальних досліджень.
Для того, щоб успішно виконати та зрозуміти наступну лабораторну роботу, необхідно згадати колоїдні та гідрофільні властивості білків. Білки, розчиняючись у воді, утворюють колоїдні розчини. Це такі розчини, діаметр частинок яких не перевищує 10-7 см. 1. РЕАКЦІЇ ОБОРОТНОГО ОСАДЖЕННЯ БІЛКІВ. Дослід 1. Висолювання білків нейтральними солями і солями лужних і лужноземельних металів. Яєчний білок складається із декількох фракцій білків, які відрізняються одна від одної за розчинністю. За допомогою методу висолювання з нього можна виділити альбуміни і глобуліни. Так, глобуліни, які мають відносну масу більшу, ніж альбуміни, осаджуються напівнасиченим розчином амоній сульфату (NH3)2SO4, а альбуміни – його насиченим розчином. Для досліду використовують розведений водою яєчний білок, до якого додано трошки натрій хлориду (білок №1), так як в слабкому сольовому розчині альбуміни і глобуліни мають однакову розчинність. У: пробірку наливають 3 мл розчину білка, додаючи однаковий обсяг насиченого розчину амоній сульфату (NH4)2SO4 та перемішують. В результаті одержують напівнасичений розчин амоній сульфату, внаслідок чого випадає осад глобуліну. Через кілька хвилин вміст пробірки відфільтровують. У фільтраті залишається інший білок — альбумін. Для висолювання альбуміну у фільтрат додають подрібнений кристалічний (NH4)2SO4 до насичення, тобто до тієї миті, коли нова порція порошку буде залишатися нерозчиненою. Випадає осад альбуміну, який відфільтровують. У фільтраті проводять біуретову реакцію, яка свідчить про відсутність білка. Осад альбуміну розчиняють в невеличкому обсязі дистильованої води. Розчин альбуміну відфільтровують і проводять з ним біуретову реакцію. Для цього в розчин для дослідження наливають такий самий за обсягом 10 %-вий розчин NaOH та 1-2 краплі 1 %-го розчину CuSO4. При наявності білка розчин набуває фіолетового забарвлення. Дослід 2. Осадження білків спиртом. Для цієї і всіх наступних реакцій використовують розведений в 20 разів водою яєчний білок (білок № 2). Наливають у пробірку 1-2 мл водного розчину білка і додають щіпку натрій хлориду. Іони солі зв'язуються колоїдними частками білка, знімають їхній заряд і тим самим зменшують сталість розчину білка. Вміст пробірки взбовтують. У пробірку поступово доливають кілька мілілітрів етилового спирту і сильно взбовтують. Через кілька хвилин випадає дрібний осад білка внаслідок дегідратації білкових часток. Якщо осадження проводять на холоді і одержаний осад швидко відокремити від спирту, то осад білка може бути знову розчинено у дистильованій воді, так що фізико-хімічні властивості його у цьому випадку не змінюються, денатурація не встигає відбутися і осадження оборотне.
2. РЕАКЦІЇ НЕОБОРОТНОГО ОСАДЖЕННЯ БІЛКІВ. Дослід 3. Осадження білків солями важких металів. У дві пробірки наливають по 2-3 мл розчину білка. Доливають по краплях у першу пробірку 0,5%-вий розчин плюмбум ацетату Pb(CH3COO)2, у другу — 5%-вий розчин купрум (II) сульфату CuSO4. Білки з солями важких металів утворюють міцні солеподібні та комплексні сполуки, які випадають в осади, нерозчинні в первісному розчинникові. Для того, щоб переконатися у необоротності реакцій осадження білка, вміст обох пробірок поділяють навпіл. До однієї половини доливають по 1-2 мл дистильованої води і переконуються у необоротності осадження білка. До другої половини додають надлишок відповідних осаджувачів: у першу пробірку 0,5%-го розчину плюмбум ацетату, у другу — 5%-го розчину купрум (II) сульфату. Спостерігають перерозчинення створеного ними осаду білка. Таке розчинення пояснюється адсорбцією надлишку іонів металу і перезарядженням білкового комплексу, внаслідок чого в розчин переходить комплекс зміненого білка з металом. Дослід 4. Осадження білків алкалоїдними реактивами. Розчини білків можуть утворювати осади додаванням алкалоїдних реактивів. До них відносяться танін (міститься в чаї), фосфорно-вольфрамова і фосфорно-молібденова кислоти, пікринова кислота, розчин Калій гексаціаноферату (ІІ) та інші. У пробірку наливають 1-2 мл розчину білка, підкислюють 2-3 краплями 10 %-го розчину оцтової кислоти і додають 2-3 краплі 5 %-го розчину калій гексаціаноферату (ІІ), вміст пробірки взбовтують після додавання кожної краплі. Випадає осад білка.
Дослід 5. Осадження білків мінеральними кислотами. Концентровані мінеральні кислоти (крім, фосфатної) викликають необоротне осадження білків з розчину. Це осадження пояснюється як явищем дегідратації білкових молекул, так і утворенням солей із білка та кислоти. Надлишок мінеральних кислот, за винятком нітратної, розчиняє осад білка, що утворився. У пробірку обережно наливають 1 мл концентрованої хлоридної або сульфатної кислоти і обережно 1 мл білка. На межі двох рідин спостерігається поява осаду білка у вигляді невеликого білого кільця. При струшуванні вмісту пробірки відбувається розчинення осаду білка в надлишку цих двох кислот. Дослід 6. Осадження білків органічними кислотами. У пробірку наливають 1-2 краплі білка і додають кілька крапель 3 %-го розчину три хлороцтової кислоти CCl3COOH. Спостерігають випадіння осаду білка. Дослід 7. Осадження білків нагріванням. У пробірку наливають 1-2 мл розчину білка і нагрівають над полум’ям горілки. Внаслідок того, що білки денатурують і переходять в нерозчинний стан, утворюється осад білка.
Результати лабораторної роботи оформлюються у вигляді таблиці 3.
Таблиця 3.
Завдання для самостійної роботи: вивчити теоретичний матеріал за темою, підготувати відповіді на контрольні питання.
Контрольні питання 1. Від чого залежить розчинність білка? Які фактори утримують білок у розчиненому стані? Які реакції осадження білків називаються оборотними і необоротними? 2. Які реагенти викликають оборотне осадження білка? Наведіть приклади, поясніть механізм дії цих реагентів. 3. Поясніть, у чому полягає практичне значення методу висолювання білків. 4. Які реагенти викликають необоротне осадження білка? Наведіть приклади, поясніть механізм дії цих реагентів. 5. Дайте визначення поняттю «денатурація». Які фактори здатні викликати денатурацію білків?
|
