Электрофоретическую

Рисунок 4. I – линия старта;

II – линия фронта;

1 – длина пятна;

2 – отрезок от линии старта до пятна;

3 – отрезок от линии старта до центра пятна - ;

4 – отрезок от линии старта до линии фронта - .

Важной характеристикой в бумажной распределительной хроматографии, так же как и в ТСХ, является Rf=x/Xf,где х — смещение зоны компонента; хf — смещение фронта растворителя. Методика определения Rf в бумажной хроматографии не отличается от соответствующей методики в ТСХ, основанной на измерениях в соответствии с рис. 1. В начальный момент времени хроматографируемая проба наносится на начальную (стартовую) линию бумажной полоски и подвергается действию подвижной фазы (растворителя). Если компоненты окрашены, через некоторое время на хроматограмме можно будет видеть отдельные цветные пятна. Первый компонент будет иметь Rf1=x1/xf,второй —R f2=X2/Xf и т. д.

При идеальных условиях коэффициент Rf определяется только природой вещества, параметрами бумаги и свойствами растворителей, но не зависит от концентрации вещества и присутствия других компонентов. В действительности коэффициент Rf в некоторой степени оказался зависящим от этих факторов и техники эксперимента.

Хроматографическая бумага должна быть химически чистой, нейтральной, инертной по отношению к компонентам раствора и подвижному растворителю и быть однородной по плотности. Имеют значение также такие свойства, как структура молекул целлюлозы в бумаге, набухаемость, ориентация волокна и другие, влияющие на скорость движения растворителя и на иные характеристики процесса.

В атмосфере водяных паров бумага поглощает значительное количество влаги (до 20...25 % своей массы), поэтому, когда неподвижной жидкой фазой является вода, никакого дополнительного увлажнения бумаги не делают. При выборе в качестве неподвижной фазы некоторых органических веществ, гидрофильную бумагу превращают в гидрофобную, пропитывая ее растворами различных гидрофобных веществ (парафина, растительного масла и др.).

В выбранных растворителях компоненты пробы должны иметь разную растворимость, иначе разделения вообще не произойдет. В растворителе, являющемся подвижной фазой, растворимость каждого компонента должна быть меньшей, чем в растворителе неподвижной фазы, но все же составлять вполне заметное значение. Это ограничение связано с тем, что если растворимость вещества будет очень велика, вещество будет двигаться вместе с фронтом растворителя, а если растворимость будет очень мала, вещество останется на начальной линии.

Для разделения водорастворимых веществ в качестве подвижной фазы обычно берут органический растворитель, а в качестве неподвижной — воду. Если вещество растворимо в органических растворителях, вода используется уже в качестве подвижной фазы, а органический растворитель является неподвижной фазой. Это так называемый метод обращенных фаз.

К растворителям обычно предъявляются следующие требования:

· растворители подвижной и неподвижной фаз не должны смешиваться

· состав растворителя в процессе хроматографирования не должен изменяться

· растворители должны легко удаляться с бумаги

· быть недефицитными и безвредными для человека.

Индивидуальные растворители в распределительной хроматографии используют относительно редко. Чаще для этой цели употребляют смеси веществ, например бутилового или амилового спирта с метиловым или этиловым, насыщенные водные растворы фенола, крезола и др., смеси бутилового спирта с уксусной кислотой, аммиаком и т. д. Применение различных смесей растворителей позволяет плавно изменять Rf и тем самым создавать наиболее благоприятные условия разделения.

В бумажной хроматографии вещества различаются по их относительному положению на бумаге после того, как растворитель пройдёт определённое расстояние. Небольшое количество раствора смеси (10-20мкл), которую нужно разделить, наносят в отмеченную точку на бумаге и высушивают. Полученное пятно называют стартовым. Затем бумагу помещают в герметичную камеру и один её конец погружают в растворитель, который является подвижной фазой. Под действием капиллярных сил растворитель движется по бумаге, растворяя и увлекая за собой компоненты образца. До начала движения образец должен полностью раствориться, поэтому скорость растворения компонентов в подвижной фазе является одним из факторов, определяющих эффективность разделения. После того, как растворитель пройдёт определённое расстояние, лист вынимают и сушат. Пятна на хроматограммах могут быть обнаружены по цвету, флуоресценции, с помощью химических реакций, для чего бумагу опрыскивают или погружают в различные реагенты, или же по радиоактивности. Идентификацию проводят обычно путём сравнения с образцами с известными величинами Rf или после элюирования, которое сводится к вырезанию зоны, содержащей пятно, и последующему промыванию её соответствующим растворителем.