Направленный мутагенезТехнология рекомбинантных ДНК позволяет выделять гены любых белков, существующих в природе, экспрессировать их в специфическом хозяйском организме и получать чистые белковые продукты. Однако физические и химические свойства природных белков часто не удовлетворяют условиям, обеспечивающим возможность их промышленного применения. Для создания белков со специфическими свойствами можно использовать подход, основанный на внесении изменений в кодирующие их клонированные гены, т.е. путем осуществления мутагенеза. Это позволяет получать белки с другими, чем у их аналогов свойствами. Внесение специфических изменений в кодирующие последовательности ДНК, приводящих к определенным изменениям в аминокислотных последовательностях, называется сайт-направленным мутагенезом. В 1993 Смит (Michael Smith) вместе с Мюллисом (Kary Mullis) получили Нобелевскую премию “за фундаментальный вклад в установление направленного мутагенеза, основанного на олигонуклеотидах, и за его развитие для изучения белков”. В настоящее время в технологии рекомбинантной ДНК наиболее часто используют два методических подхода сайт-направленного мутагенеза. Первый из них (рис. 47) включает встраивание ДНК-мишени в плазмидный вектор, которым трансформируют клетки E. coli, выделяют клонированную и двухцепочечную плазмидную ДНК и денатурируют щелочью, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с синтезированным химическим путем олигонуклеотидом с измененной последовательностью нуклеотидов, например с однонуклеотидной заменой в заранее определенном месте. Гибридизовавшийся олигонуклеотид служит затравкой для синтеза ДНК, а интактная кольцевая молекула ДНК – матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются с помощью ДНК-лигазы Т4. По окончании синтеза и лигирования продуктами реакции трансформируют клетки E. coli. Клетки, несущие мутантный клонированный ген, идентифицируют с помощью гибридизации.
Рис. 47. Сайт-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК
А второй позволяет проводить сайт-направленный мутагенез с использованием пары праймеров,со встроенным “мутантным” нуклеотидом. Cинтезируют пару праймеров, несущих мутацию, и пару праймеров, комплементарных концам нужного фрагмента ДНК. В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией, которые объединяют в третьей реакции. Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию.
|
