Векторы для клонирования ДНКВ основе молекулярного клонирования лежит встраивание нужного фрагмента ДНК (вставки) в другую молекулу ДНК (вектор), которая способна включать в себя новые последовательности ДНК, обеспечивать их перенос в системы, где созданная in vitro ДНК будет воспроизводиться in vivo, давая начало новому клону клеток, отличному фенотипически от исходных клеток хозяина (реципиента). Исходя из этого, вектор, в данном случае генетический, представляет собой молекулу ДНК, которая должна соответствовать определенным требованиям. 1. Способность к автономной репликации, т.е. обладание ori (точка инициации репликации). Другими словами – генетический вектор должен содержать последовательности нуклеотидов, обеспечивающие не только его собственную репликацию, но и воспроизведение встроенной в него вставки чужеродной ДНК. 2. Наличие в структуре вектора хотя бы одного уникального, т.е. встречающегося на молекуле ДНК только один раз, сайта для какой-либо эндонуклеазы рестрикции, по которому происходит встраивание вставки ДНК. 3. Наличие в структуре ДНК вектора селективного маркера – гена или генов, кодирующих белки, которые отсутствуют в клетках реципиента, например – белки, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам. Это обеспечивает возможность вести отбор клонов, содержащих вектор со встроенной вставкой ДНК. 4. Небольшой размер ДНК вектора. 5. Обеспечение достаточной копийности в клетке-хозяине.
Рассмотрим подробно группу векторов, которые носят название плазмидные, поскольку созданы на базе природных генетических элементов бактерий и удовлетворят практически всем требованиям, предъявляемым к генетическим векторам. Рассмотренные выше подходы манипулирования ДНК прежде всего применялись для создания удобных и надежных плазмидных векторов.
|
