Работа № 1. определения общей активности креатинкиназы в сыворотке крови.

Принцип метода:

В ходе последовательных реакций происходит восстановление НАДФ:

1) Фосфокреатин + АДФ ← креатинкиназа → креатин + АТФ

2) АТФ + глюкоза ← гексокиназа → АДФ + глюкозо-6-фосфат

3) глюкозо-6-фосфат + НАДФ ← глюкозо-6-ф-дегидрогеназа → 6-фосфоглюконат + НАДФ•Н

Скорость восстановления НАДФ в НАДФ•Н пропорциональна активности креатинкиназы в пробе. Изменение концентрации НАДФ•Н определяют фотометрически на спектрофотометре при длине волны 340 нм. Фотометрирование против воздуха.

Температура инкубации: 25 ˚С.

Исследуемый материал: 1) сыворотка крови №1 контрольной крысы 2) сыворотка крови №2 крысы с искусственной ишемией мышечной ткани (лаборант за 10 минут до взятия крови у крысы перетягивает лапу).

Диагностическое значение:Креатинкиназа, именуемая также креатинфосфокиназой (АТФ: креатинфосфотрансфераза КФК, КК; КФ 2.7.3.2) пред­ставляет собой энзим, обратимо катализирующий фосфорилирование креатина при помощи АТФ:

Креатин + АТФ→АДФ + креатинфосфат.

Креатинкиназа (молекулярная масса 81 000 Д) играет важную роль в энергетическом обмене мышечной, нервной и других тка­ней. Наиболее богаты ею скелетная мускулатура, миокард, матка и мозг. Достаточно высокая активность фермента выявляется в щито­видной железе и легких. В остальных органах, в том числе в пече­ни, а также в эритроцитах обнаруживаются лишь «следы» актив­ности КК.

Молекула фермента имеет димерную структуру, при комбинации этих субъединиц образуется три изофермента: ММ — мышечный, ВВ — мозговой и MB — гибридный, содержа­щийся в большом количестве в сердечной мышце. В миокарде со­держится два изофермента — MB и ММ, причем активность изо­фермента MB составляет около 25% от общей энзиматической активности. Разделение креатинкиназы на отдельные изоферменты осуществляют с помощью электрофореза.

Определение общей активности креатинкиназы и ее изоформ требует­ся в основном для диагностики миопатий, инфаркта миокарда, заболеваний центральной нервной системы.

Повышение активности КК может указывать на:

инфаркт миокарда (ММ, ВМ): рост активности начинается через 4—6 ч. после инфаркта, самая высокая активность отмечается через 18—30 ч. (превышение нормы в 5-10 раз), через 72 часа активность КК, как правило, нормализуется;

миодистрофии (При прогрессирующей мышечной дистрофии активность КФК может увеличиваться в 50 и более раз по сравнению с нормой), выраженные изменения при миодистрофии Дюшенна;

внутримышечные инъекции тетрациклина, некоторых пенициллинов, хлорпромазина, диазепама, др.антибиотиков, седативных средств;

полимиозит;

травма мышц (краш-синдром);

отравление стрихнином, окисью углерода;

состояние после операционного вмешательства;

травмы головы;

гипофункцию щитовидной железы (тироксин ингибирует креатинкиназу).

острую лучевую болезнь;

тяжелую физическую нагрузка.

Значения активности общей креатинкиназы в сыворотке крови (при 25˚С) у здоровых людей: мужчины - до 80 U/л, женщины - до 70 U/л, новорожденные (2-12 мес.) - до13б U/л, дети - до 94 U/л. Каталитическая концентрация КК сыворотки крови здоровых людей приходится в основном на изоферменты КК-ММ, доля КК-МВ в ней составляет лишь 1—3% от общей каталитической концентрации креатинкиназы.