Методы измерения АОЕ

Исходя из анализа данных литературы, можно сделать вывод о том, что нет единой и достаточно полной классификации методов определения антиоксидантной ёмкости. Различают три типа методов для определения АОЕ, основанных на следующих измерениях [11]:

1) потребление кислорода;

2) образование продуктов окисления;

3) связывание свободных радикалов.

Для оценки антиоксидантной ёмкости используются 2 способа: определение концентрации отдельного антиокислительного компонента (например, витамина Е), либо определение общей (интегральной) антиокислительной активности (к ним относят, например, метод ORAC).

Различные методы для определения АОЕ представлены на рисунке 1.1. Практически во всех этих методах применяется модельная реакция окисления какого-либо соединения. АОЕ отдельного соединения или смеси оценивается по влиянию антиоксиданта на протекание модельной реакции. Мониторинг кинетики реакции осуществляется на основе данных по поглощению кислорода, полученных способом измерения различных характеристик исследуемого объекта – изменения поглощения электромагнитного излучения (электрохимические методы), люминесценции, флуоресценции,оптической плотности (спектрофотометрические методы) и др.

Рисунок 1.1 - Методы определения антиоксидантной ёмкости, классифицированные по способу регистрации

 

Методы определения АОЕ также подразделяют на прямые методы и косвенные. Прямые методы основаны на «гашении» свободных радикалов, генерируемых в среде. К прямым методам относят [10]: спектрофотометрию, флуориметрию, полярографию, хемилюминесценцию, газохроматографию, ЭПР-спектроскопию.

К косвенным методам относят измерения различных физико-химических параметров объекта исследования [4]: определение общего содержания фенольных соединений, флавоноидов и др.; анализ спектров поглощения; определение концентрации растворенного кислорода; определение pH; измерение окислительно-восстановительного потенциала.

Также существует ещё один подход изучения АОЕ, учитывающий преимущественный механизм, по которому протекает реакция гашения радикала. Этот подход применим только для прямых методов определения АОЕ. Механизмы «гашения» радикалов при оценке АОЕ:

1) Донирование протона:

Х• + АН → ХН + А•, (5)

Доминирует в случае энергии диссоциации связи в протон-донорной группе Е ~ -10 ккал/моль и изменении потенциала ионизации DПИ < – 36 ккал/моль. Методы с преобладанием этого механизма характеризуются малой зависимостью получаемых показателей от рН и используемого растворителя.

2) Перенос электрона:

Х• + АН → Х^¯ + АН•⁺, (6)

АН•⁺ + Н₂О → А• + Н₃О⁺, (7)

Х^¯ + Н₃О⁺ → ХН + Н₂О, (8)

Меⁿ⁺ + АН → АН⁺ + Ме^(n-1)+. (9)

Как правило, реакция сочетает оба механизма, но только один из них становится преобладающим в зависимости от различных условий.

В ходе исследования антиоксидантной ёмкости различных веществ у учёных возник вопрос о стандартах, с помощью которых можно было бы сравнить результаты своих исследований с антиоксидантной ёмкостью уже известных антиоксидантов и с данными, опубликованными в литературе, а также полученными в других лабораториях. Вначале использовали показатель процента ингибирования, отражающий долю, на которую снижается концентрация свободных радикалов в среде под действием антиоксиданта. Но оказалось, что по этому показателю трудно сравнивать результаты, которые получены по разным методикам или при разных концентрациях антиоксиданта. Поэтому сегодня стал использоваться универсальный показатель ТЕАС (trolox equivalent antioxidant capacity - антиоксидантная ёмкость в эквивалентах тролокса). Trolox или по-русски «тролокс» (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота) является водорастворимым аналогом витамина Е (токоферола). Тролокс принят за стандарт для оценки антиоксидантной ёмкости, и его активность принимается за 1,0. Также для оценки антиоксидантной ёмкости иногда используются и некоторые другие характеристики. К ним относятся эквиваленты аскорбиновой кислоты и несколько реже эквиваленты галловой кислоты. Показатель С 1/2 - концентрация антиоксиданта, при которой наблюдается 50%-е ингибирование (нейтрализуется половина свободных радикалов, образующихся в ходе реакции) исследователи считают также весьма удобным, особенно в случае определения индивидуальных соединений.