Занятие № 17
ТЕМА: БЕЛКИ ПЛАЗМЫ КРОВИ. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ
Цель занятия: 1.Знать основные белки плазмы крови, их функции и особенности структуры. 2.Ознакомиться с методами разделения белков. Исходный уровень знаний: - структура и биологическая роль белков; - классификация белков; - различие альбуминов и глобулинов; - энзимодиагностика. Содержание занятия. I.2. Физиологическая роль белков плазмы крови. Характеристика отдельных белков. Понятие о нормо-, гипо- и гиперпротеинемии. Диспротеинемии, парапротеинемии, дефектопротеинемии. Эмбриоспецифические белки.
II.1.Работа № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ МЕТОДОМ Принцип метода. Метод основан на образовании окрашенного в фиолетовый цвет комплекса пептидных связей белка с ионами двухвалентной меди (сульфата меди) в щелочной среде (биуретовый комплекс). Интенсивность окраски раствора пропорциональна концентрации белка в сыворотке и определяется фотометрически. Порядок выполнения работы:
Осторожно перемешать, оставить на 30 минут в штативе при комнатной температуре. Фотоколориметрировать при зеленом светофильтре 540 нм против контрольного раствора. Определив экстинкцию исследуемого раствора, найти по графику, какой концентрации белка (в г/л) она соответствует. РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД:
Клинико-диагностическое значение. Нормальное содержание общего белка в сыворотке крови у взрослых 65-85 г/л (6,5-8,5 г%), у детей до 6 лет - 56-85 г/л (5,6-8,5г%). Повышение содержания белка (гиперпротеинемия) наблюдается при ревматизме и миеломной болезни (плазмоцитоме) - до 120-150 г/л. Кратковременная относительная гиперпротеинемия отмечается при сгущении крови из-за значительных потерь жидкости, например, при усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, профузных поносах, несахарном диабете, холере, тяжелых ожогах. Понижение уровня белка (гипопротеинемия) имеет место при нефритах, злокачественных опухолях, алиментарной дистрофии. Работа № 2. ТИМОЛОВАЯ ПРОБА. Принцип метода. Патологически повышенные b-глобулины, g-глобулины и липопротеиды осаждаются из сыворотки крови насыщенным тимолом. Измеряют интенсивность помутнения, зависящую от содержания белковых фракций и их количественных соотношений. Порядок выполнения работы
Перемешать и выдержать точно 30 минут при комнатной температуре, после этого вновь перемешать и измерить оптическую плотность пробы против раствора сравнения в 1 см кювете при длине волн 650 нм (светофильтр № 4). РЕЗУЛЬТАТ:
ВЫВОД: Клинико-диагностическое значение. Нормальные величины: 0-4 единиц S-H (единицы помутнения по Shank-Hoagland ). Повышение тимоловой пробы наиболее характерно для заболеваний печени (ещё до появления желтухи). Патологические величины - более 5 единиц S-H.
Работа № 3. ПРОБА ВЕЛЬТМАНА Принцип метода. При добавлении к сыворотке раствора хлорида кальция и нагревании происходит нарушение коллоидальной устойчивости сыворотки. Порядок выполнения работы. К 0,1 мл сыворотки прибавить 4,9 мл воды, перемешать, опрокидывая пробирку, и прибавить 0,1 мл 0,5% раствора хлорида кальция. Встряхивать и нагревать пробирку над пламенем до однократного закипания смеси. Охладить пробирку и осмотреть на свету. Если хлопьев нет, то в эту же пробирку добавить еще 0,1 мл хлорида кальция и вновь прокипятить. Процедуру повторить, пока не выпадут хлопья. Результаты оценить, подсчитав общее количество пошедшего на реакцию хлорида кальция. РЕЗУЛЬТАТ: ВЫВОД:
Клинико-диагностическое значение. В норме коагуляция наступает при прибавлении 0,4-0,5 мл раствора хлорида кальция. Проба Вельтмана снижена при паренхиматозном поражении печени и малярии. Коагуляция при добавлении большего количества раствора хлорида кальция наблюдается при ревматизме, туберкулезе легких.
Все последующие работы демонстрируются преподавателем.
Работа № 4. РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В АГАРЕ ПО ОУХТЕРЛОНИ Принцип метода.
Рис. 4. Полуколичественный учет результатов анализа. 1- антисыворотка, 2 -тест-антиген, 3-10 - последовательное разведение исследуемой пробы: 1/1, 1/2, 1/4, и т.д. до 1/128.
Работа № 5. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА НА БУМАГЕ, В АГАРОВОМ И В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЯХ Принцип метода. Молекулы белков обладают свободным электрическим зарядом, величина которого и знак зависят от соотношения основных и кислых ионизированных групп в молекуле. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы белка передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Разделение смеси белков на отдельные фракции происходит в результате различия относительной молекулярной массы и зарядов молекул белков, которые перемещаются в электрическом поле неодинаково. Скорость передвижения белковых молекул пропорциональна величине их свободного заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации. Электрофоретическое разделение белков широко используется как для диагностики заболеваний, так и для препаративных целей.
Рис. 5а. Разделение сыворотки крови человека с помощью электрофореза в геле агарозы и кривые, полученные при денситометрическом измерении электрофореграмм. Нормальная сыворотка (А) и сыворотки больных с множественной миеломой (Б), циррозом печени (В) и нефротическим синдромом (Г).
Рис.5б. Разделение белков сыворотки крови в полиакриламидном геле с линейным градиентом концентраций в пределах 4-30%.
Работа № 6. РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА Принцип метода. Иммуноэлектрофорез впервые был предложен Грабарем и Уильямсом в 1953 году и представляет собой комбинацию электрофоретического разделения белков с последующей иммунопреципитацией в геле, что значительно повышает чувствительность метода. С помощью иммуноэлектрофореза можно провести анализ антигенной смеси, качественное и количественное определение известного антигена. Так, например, в сыворотке крови здорового взрослого человека данным методом можно выделить более 30 различных белковых фракций. В зависимости от поставленных целей можно использовать различные варианты иммуноэлектрофореза.
|
