Реактиви. 1. Суміш розчинників н-бутанол, оцтова к-та, вода в об¢ємному співвідношенні 4:1:5 (40 мл н-бутанолу1. Суміш розчинників н -бутанол, оцтова к-та, вода в об¢ємному співвідношенні 4:1:5 (40 мл н -бутанолу, 10 мл оцтової к-ти, 50 мл дист. води) струшують протягом 1-2 хв. в ділильній воронці. Після розшарування нижній шар зливають, а верхній використовують як рухому фазу. 2. 0,5%-й розчин нінгідрину в ацетоні (95 частин 0,5%-го розчину нінгідрину в ацетоні, 1 частина льодяної оцтової к-ти і 4 частини води) змішують безпосередньо перед визначенням. 3. 0,03 М розчини різних амінокислот (наважку амінокислот, що відповідає 0,03 М розчину, розчиняють в 0,01 н соляній кислоті). 4. Розчини суміші амінокислот невідомої концентрації. Матеріали та обладнання Силуфолові пластинки, шприци, контейнери з кришкою для суміші розчинників, контейнери з кришкою для розчину нінгидрину, витяжна шафа, термостат або сушильна шафа, лінійка, олівець Загальні відомості Хроматографія (хромо — колір, графо — пишу) це фізико-хімічний метод розділення рідких та газоподібних сумішей на складові. Хроматографічний метод, описаний вперше М.С. Цвєтом у 1903 р., широко використовується в біохімії, мікробіології, а також у промисловості для одержання, очистки та ідентифікації органічних та неорганічних сполук. Він дає змогу розділяти та аналізувати складні суміші речовин, очищати їх від домішок, концентрувати та ідентифікувати речовини. Всі хроматографічні системи складаються, як правило, з двох фаз: нерухомої, яка може бути твердою або рідкою, та рухомої, яка рухається по нерухомій фазі. Рухома фаза, в потоці якої переміщується суміш, що розподіляється, називається елюентом, а розчин, який виходить з шару нерухомої фази та містить розчинені компоненти суміші – елюатом. Поведінка молекул в хроматографічних процесах визначається будовою та характером хімічних зв¢язків між окремими атомами та групами, взаємодією частинок речовини що розділяється і фази, з якою ці частинки стикаються. Хроматографічні методи класифікують за такими ознаками: 1. За агрегатним станом — газова, рідинна, газорідинна хроматографія; 2. За механізмом розділення — адсорбційна, іонообмінна, розподільна хроматографія. 3. За формою проведення процесу — колоночна, капілярна, площинна. За напрямком руху елюента (рухома фаза) площинну тонкошарову хроматографію розділяють на висхідну та низхідну: - якщо елюент рухається знизу вверх, хроматографія називається висхідною (А); - якщо зверху вниз - низхідною (Б) хроматографією (рис. 1.1).
Рис.1.1. Тонкошарова хроматографія. А – висхідна; Б – низхідна (вид збоку); В – хроматограма з розділеними і проявленими плямами амінокислот: 1 – фронт розчинника, 2 – розділені амінокислоти, 3 – місце нанесення зразка.
Для характеристики поведінки зон речовин, що хроматографуються у паперовій хроматографії вводять величину хроматографічної рухомості Rf: Хроматографічна рухомість Rf (рис. 1.2)речовини в даній системі розчинників характеризується відношенням: - відстані між стартом (точкою нанесення речовини на хроматограму) та положенням максимума концентрації в плямі речовини на хроматограмі до відстані, що пройшов розчинник від лінії старту до лінії фінішу (відповідає положенню фронту рідини, зупиненому на певній відстані від краю пластинки). l Rf = -----, де L l - шлях, пройдений розчиненим компонентом від старту до центру плями; L - шлях, пройдений фронтом розчинника від старут до фінішу.
На величину Rf впливає наявність в речовині функціональних груп (-СООН, -ОН, -NН2, -NO2, -H, -Cl), водневі зв¢язки всередині молекули амінокислоти, що знижують розчинність речовин в воді та полярних розчинниках, температура плавлення, електролітична дисоціація, здатність до утворення комплексних сполук, рН рухомої фази та ін.
Рис. 1.2. Визначення Rf компонентів суміші
Розподільна хроматографія в тонкому шарі (ТШХ). У цьому методі хроматографія відбувається в тонкому шарі сорбенту нанесеному на тверду інертну пластинку. Найбільшого поширення набули пластинки з підкладкою виготовлену з алюмінієвої фольги або полімеру. Частіше всього адсорбентом може бути сілікагель, оксид алюмінію, целюлоза, поліамід та ін. Для більш міцного закріплення адсорбента на жорсткій пластині-підложці використовують реагенти для зв¢язування (гіпс, крохмаль, силіказоль та ін.). Суміш адсорбента з цим реагентом наносять на підложку дуже тонким шаром (біля 100 мкм). Ми користуємося цим видом хроматографії для визначення амінокислот в суміші, що наноситься на силуфолову пластинку. В якості рухомої фази використовується суміш розчинників н-бутанол: оцтова кислота: вода у співвідношенні 4:1:5, відповідно. Відносне положення амінокислот на хроматограмах, отриманих в даній суміші показано на рисунку 1.3.
Рис. 1.3. Відносне положення амінокислот на хроматограмах Підготовка до проведення лабораторної роботи Студенти розділяються на бригади по 4 особи. Лаборант видає кожній бригаді 1 силуфолову пластинку. Щоб запобігти забрудненню силуфолової пластинки її необхідно обережно тримати за бокові грані. Для загального доступу лаборант готує розчини відомих амінокислот для кожної бригади та суміш невідомих амінокислот відповідно до номера бригади. Бригади одержують завдання, які амінокислоти взяти для виконання роботи та № суміші невідомих амінокислот (згідно номера бригади). 1 бригада – аргінін, валін, гліцин. Суміш №1 2 бригада – аспарагінова к-та, лейцин, треонін. Суміш №2 3 бригада – гліцин, лізин, фенілаланін. Суміш №3 4 бригада – треонін, фенілаланін, серин. Суміш №4 5 бригада – аргінін, глутамінова кислота, лейцин. Суміш №5 6 бригада – серин, треонін, валін. Суміш №6 7 бригада – фенілаланін, аспарагінова кислота, аланін. Суміш №7 8 бригада – валін, аспарагінова кислота, тирозин. Суміш №8 9 бригада – серин, лейцин, треонін. Суміш №9
Студенти проводять попереднє тренування в нанесенні води на звичайний папір за допомогою шприца. Олівцем підписують пластинку (прізвище та № бригади). Члени бригади беруть пробірки з розчинами відомих амінокислот, наносять їх на точки 1, 2 та 3 на пластинці і повертають розчини на стіл. Потім беруть розчин суміші невідомих амінокислот відповідно номеру бригади і наносять на точку 4.
Хід роботи На силуфоловій пластинці олівцем відмічають лінію старту (1,5-2 см від нижнього краю пластинки) та 4 точки для нанесення розчинів суміші відомих амінокислот та розчину невідомої суміші (рис. 1.4.). За допомогою шприца на точки 1, 2, 3 наносять однакові об'єми розчину відомих амінокислот (по 3 краплі), причому кожну наступну краплину наносять після просушування попередньої на повітрі. На точку 4 наносять 4 краплини суміші невідомих амінокислот.
Рис. 1.4. Нанесення точок на силуфолову пластинку
Після нанесення всіх розчинів амінокислот пластинку висушують на повітрі і розміщують в герметичному контейнері (рис.1.5), на дно якого наливають шар розчинника (елюента) товщиною 1,0 см так, щоб нижній край пластинки був занурений на 0,5-1,0 см в розчинник. Необхідно слідкувати, щоб поверхня розчинника була нижче від лінії старту на 0,5-1 см. Верхній край пластинки закріплюють тримачем. Щоб уникнути випаровування елюента, хроматографію проводять в закритих камерах, що забезпечує рівновагу між рухомою рідкою фазою та її парами. Робота з органічними розчинниками проводиться у витяжній шафі.
Рис.1.5. Типова камера для проведення хроматографічного розділення: 1 – розчинник; 2 – пластинка з шаром сорбенту; 3 - точка нанесення розчину суміші амінокислот; 4 – точки нанесення розчинів амінокислот; 5 – лінія фронту; 6 – лінія старту. Відмічаємо час початку та закінчення хроматографії. Під час проведення хроматографії спостерігають за рухом фронту розчинника (розгонка). Хроматографія вважається закінченою, коли фронт руху розчинник знаходиться за 1-1,5 см від верхнього краю пластинки. Після закінчення хроматографічного розділення амінокислот пластину дістають з контейнера, висушують на повітрі в чистій витяжній шафі при кімнатній температурі. Щоб визначити місцезнаходження невидимих плям амінокислот, тобто проявити пластинку, її обробляють реактивами, специфічними для речовин що розділяються. У випадку амінокислотних сумішей пластину занурюють на кілька секунд у кювету з 0,5 %-м розчином нінгідрину в ацетоні, просушують на повітрі і протягом 15 хвилин прогрівають для проявлення забарвлення в термостаті при 60 °С. На проявленній та висушеній хроматограмі плями амінокислот обмальовують олівцем, щоб зберегти місцезнаходження окремих амінокислот, ідентифікують плями відомих амінокислот та визначають амінокислотний склад невідомої суміші, порівнюючи положення окремих її плям з положенням стандартів. Вимірюючи відстань між лінією старту і центром плями кожної амінокислоти, знаходять величину хроматографічної рухомості Rf (відношення довжини пробігу кожної плями амінокислоти до довжини пробігу розчинника, яка вимірюється відстанню між стартовою лінією та лінією фінішу розчинника). Завдання для виконання 1. Ознайомитися з правилами роботи в лабораторії та технікою безпеки. 2. Підготувати силуфолову пластинку до хроматографії (відмітити лінію старту та точки 1, 2, 3, 4). Підписати. 3. Нанести розчини відомих амінокислот на точки 1, 2, 3 та розчин суміші невідомих амінокислот на точку 4. 4. Розмістити пластинку в камері з розчинником. 5. Записати час початку і закінчення хроматографії. 6. Визначити тривалість хроматографії. 7. Висушити хроматограму. 8. Проявити хроматограму. 9. Ідентифікувати плями амінокислот виявлені на силуфоловій пластинці та обвести кожну пляму олівцем. 10. Визначити амінокислоти, що входили до складу невідомої суміші. 11. Вирахувати хроматографічну рухомість (Rf) окремих плям амінокислот. 12. Оформити протокол заняття, зробити висновок (написати назву амінокислот в складі невідомої суміші, визначити Rf кожної амінокислоти невідомої суміші, час хроматографії). Один член бригади вклеює пластинку в зошит, інші – замальовують пластинку з плямами відомих амінокислот та невідомої суміші.
Контрольні запитання 1. Дати визначення терміну "хроматографія". 2. Хто вперше описав цей метод. 3. Що таке елюент, елюат. 4. Класифікація хроматографічних методів. 5. Що таке хроматографічна рухомість, як її визначають. 6. Тонкошарова хроматографія на силуфоловій пластинці. 7. Що таке силуфолова пластинка. 8. Рухома і нерухома фази в даному методі. 9. Яке співвідношення розчинників використовується в даній роботі. 10. Як і чим проявляють плями амінокислот. РЕКОМЕНДОВАНА ЛІТЕРАТУРА 1. Лисенко, О.М. Вступ до хроматографічного аналізу. Навчальний посібник / О.М. Лисенко, Б.Й. Набиванець.- К.: Корвін Пресс, 2005. - 187 с. 2. Бёккер, Ю. Хроматография. Инструментальная аналитика: Методы хроматографии и капиллярного электрофореза / Ю.Бёккер. - М.: Техносфера, 2009.- 470 с.
|
