Постановка ИФА

1. Промывание лунок планшетов после адсорбции МкАт.

Планшеты, сенсибилизированные накануне МкАт, трижды промывают раствором 2. Сначала содержимое лунок удаляют в емкость с дезраствором (5-6%-ный раствор перекиси водорода) путем встряхивания планшета, а затем заполняют лунки раствором 2 не менее, чем на 3/4 их объема и оставляют на 2-3 минуты, каждый раз удаляя содержимое встряхиванием планшета. Планшеты просушивают фильтровальной бумагой. На данном этапе заразный материал отсутствует.

2. Внесение контрольных и исследуемых проб (см. схему).

Лунки от A до H первого и второго рядов планшетов предназначены для внесения отрицательного и всех положительных контролей.

В лунки A1 и A2 каждого планшета вносят по 0,1 мл содержимого ампулы из набора «Отрицательный контроль» (проверка специфичности реакции, на схеме «К-»).

В остальные лунки рядов 1 и 2 (от B до H включительно) вносят по 0,1 мл раствора 2.

В лунку B1 вносят 0,1 мл рабочего разведения положительного контроля - раствора 3, содержимое лунки перемешивают и титруют с двукратным шагом в направлении к лунке H1, получая таким образом разведения анатоксина от 1:8000 в лунке B1 до 1:512000 в лунке H1 с содержанием Lf/мл в лунках: B1 - 0,0375; C1 - 0,018; D1 - 0,009; E1 - 0,004; F1 - 0,002; G1 - 0,001; H1 - 0,0005 (на схеме «К+»). В лунку B2 внося 0,1 мл верхнего слоя среды культивирования контрольного токсигенного штамма (положительный контроль среды культивирования) и титруют с двукратным шагом от 1:2 до 1:128 (на схеме - «К+ср»).

Исследуемый материал (на схеме - «X, Y и т.д.») вносят по две лунки в 3-12 ряды по 0,1 мл верхнего слоя среды культивирования. При инструментальном учете исследуемые пробы разводят в 4 раза перед внесением в лунки.

Планшеты накрывают сухими крышками и помещают в термостат на 1 час при температуре 37⁰ С.

3. Промывание лунок планшетов, содержащих патогенный материал.

Промывание осуществляют с соблюдением правил работы с инфекционным материалом. После инкубирования планшетов в термостате содержимое лунок удаляют либо пипеткой (с грушей), либо с помощью насоса (водоструйного или типа ОХ-10). Поверхность планшетов промокают тампоном или сложенной в 4-5 слоев фильтровальной бумагой, увлажненной тем же дезраствором. Не допускается попадания дезраствора в лунки! Планшеты промывают трижды раствором 2, удаляя содержимое лунок как указано выше. Планшеты промокают фильтровальной бумагой для удаления промывающего раствора.

 

Схема расположения на планшете контрольных и исследуемых проб при постановке ИФА

Титр анатоксина (в тысячах)	в Lf/мл	Титр среды культивир. токсигенн. штамма	Буквенное обозначение рядов	Цифровые обозначения рядов
							4...12
			A	K-	K-	X	Y
1:8	0,0375	1:2	B	K+	K+ср	X	Y
1:16	0,018	1:4	C	K+	K+ср	и т.д.
1:32	0,009	1:8	D	K+	K+ср
1:64	0,004	1:16	E	K+	K+ср
1:128	0,002	1:32	F	K+	K+ср
1:256	0,001	1:64	G	K+	K+ср
1:512	0,0005	1:128	H	K+	K+ср

Обозначения: К- - отрицательный контроль из набора; К+ - положительный контроль из набора; К+ср - положительный контроль среды культивирования; X, Y - исследуемые пробы.

 

4. Приготовление рабочего разведения конъюгата - раствора 4.

Используют рабочее разведение конъюгата 1:500, для чего в ампулу из набора «Конъюгат антитоксический поликлональный» вносят 0,54 мл раствора 2, тщательно перемешивают (разведение 1:10 при необходимости можно хранить при 4⁰ С до 2-х недель); затем полученное разведение переносят (0,6 мл) в мерную емкость и доводят объем до 30 мл раствором 2 (разведение 1:500 хранению не подлежит!).

5. Внесение конъюгата в лунки планшетов.

Во все лунки промытых планшетов вносят по 0,1 мл конъюгата в рабочем разведении - раствора 4. Планшеты накрывают сухими крышками и помещают в термостат на 1 час при температуре 37⁰ С. После инкубирования планшеты промывают не менее 5 раз, стряхивая содержимое в емкость с дезраствором. Планшеты промокают фильтровальной бумагой для удаления промывающего раствора.

6. Приготовление рабочего разведения 5-АС - раствора 5.

Готовят 0,08% раствор 5-АС, для чего содержимое флакона (24 мг) растворяют в 30 мл дистиллированной воды, подогретой до 80⁰ С; раствор охлаждают. При необходимости его можно хранить при 4⁰ С до 2-х недель. Перед употреблением 0,08% раствор 5-АС подщелачивают под контролем ионометра 4%-ным раствором гидроксида натрия (NaOH) до pH 5,9-6,0 (подщелоченный раствор 5-АС хранению не подлежит!).

7. Приготовление 0,05%-ного раствора перекиси водорода - раствора 6.

Готовят из 3%-ного раствора перекиси водорода путем разведения его в 60 раз свежеперегнанной холодной дистиллированной водой. Например, для получения 3,6 мл 0,05%-ного раствора к 0,06 мл перекиси водорода 3%-ной концентрации добавляют 3,54 мл дистиллированной воды. Раствор можно хранить при 4⁰ С в полиэтиленовой или парафинированной посуде не более 2-х недель.

8. Приготовление субстратной смеси - раствора 7.

Готовится за 5-10 мин до внесения в лунки планшетов (!) путем смешивания 9 частей раствора 5 (5-АС) pH5,9-6,0 с 1 частью раствора 6 (0,05%-ный раствор перекиси водорода). Для приготовления 30 мл субстратной смеси к 27 мл раствора 5 добавляю 3 мл раствора 6. Цвет субстратной смеси - желтовато-золотистый. Этот раствор хранению не подлежит!

9. Внесение субстратной смеси в лунки планшетов.

Во все лунки планшетов вносят по 0,1 мл раствора 7, планшеты накрывают сухими крышками и оставляют при комнатной температуре. Через 25-35 мин приступают к учету реакции.