Определение каталазной активности в интактных эритроцитах по методу КрайневаОб активности каталазы можно судить либо по количеству перекиси водорода, разложившейся под влиянием этого фермента, либо по количеству выделившегося при этом кислорода. По методу Крайнева активность каталазы выражают в микромолях перекиси водорода, разложенной 1 мл крови в течение минуты. Каталаза крови содержится почти исключительно в эритроцитах. Активность этого фермента снижается при некоторых заболеваниях, например анемии, туберкулезе, раке и др. Ход работы: 1. Приготовить суспензию эритроцитов: отмерить в пробирку 5 мл 0,85% раствора хлористого натрия и добавляют туда 0,1 мл крови, тщательно перемешивая. 2. Отмерить в две пробирки по 5 мл 10% раствора серной кислоты. 3. Отмерить в два тигля по 2 мл 0,5 М раствора перекиси водорода. 4. Отмерить в два стакана по 6 мл 0,85% раствора хлористого натрия и по 2 мл суспензии эритроцитов. 5. С помощью пинцета поместить на дно каждого стакана тигель с перекисью водорода. 6. В первый стакан (контроль) влить из пробирки 5 мл 10% раствора серной кислоты и перемешать содержимое (инактивация каталазы). 7. Второй стакан с тиглем (опыт) вращают до перемешивания содержимого, каталаза эритроцитов начинает разлагать перекись водорода. Перемешивание продолжают в течение 30 секунд, после чего вливают в него 5 мл 10% раствора серной кислоты из пробирки. Реакция приостанавливается. Избыток перекиси водорода в обоих стаканах (опыт и контроль) титруют 0,1N раствором перманганата калия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 30 секунд. Вычисление производят по формуле:
0,04 ´ 34
1 мл 0,1N раствора KMnO4 эквивалентен 1,7 мг перекиси водорода 0,04 – количество крови в стакане А – количество миллилитров 0,1N раствора KMnO4, пошедшего на титрование контрольного стакана, В – количество миллилитров 0,1N раствора KMnO4, пошедшего на титрование опытного стакана, В норме активность каталазы равна 12-20 ммоль/мл/мин.
|
(А - В) ´ 1,7 ´ 2
