Желточно-солевой агар

а) Агар мелко измельчают (1, 8-2, 0 г), добавляют 100 мл дистиллированной воды, рН 7, 1-7, 2, прогревают до расплавления агара, остужают до 50⁰ С.

б) Соблюдая правила асептики, вносят 20 % желточную взвесь (желток, асептически извлеченный из куриного яйца, взбалтывают в 200 мл изотонического раствора хлорида натрия).

в) Взвесь смешивают, разливают по 20 мл в чашки Петри. Хранят в холодильнике до употребления (две недели). Используют как элективную среду для выделения стафилококка.

3. Среда Китта-Тароцци

Бычью печень или другие органы (можно плаценту) нарезают мелкими кусочками, заливают трехкратным количеством МПБ, рН 7, 4-?, 6, кипятят 30 мин. Бульон фильтруют, а печень промывают водопроводной водой, просушивают с помощью фильтровальной бумаги. Распределяют по пробиркам по 3-4 г печени и по 7-8 мл МПБ. Стерилизуют 30 мин при 1 атм. Применяют для выделения анаэробов.

Элективными являются среды для первичного выделения энтеробактерий: Плоскирева (угнетает рост многих бактерий, способствует росту сальмонелл и шигелл), Эндо (различает лактозо (+) и лактозо (-) бактерии кишечной группы), висмут-сульфит агар (элективен для сальмонелл, ингибирует рост других бактерий) и пр.

Среда П-2.

Применяется для выделения протея. В 100 мл растопленного 2 % агара добавляют 3 мл дрожжевого экстракта, 1 г маннита, 1 г мальтозы, 0, 8 г желчных солей, 0, 2 г цитрата железа аммонийного, 0, 05 г гипосульфата натрия, 2, 5 г/мл 0, 01 % раствора кристаллического фиолетового, 0, 5 мл щелочного раствора фенолового красного, рН 7, 4-7, 7. Стерилизуют при 0, 5 атм 15 мин. Добавляют 10-12 тыс ЕД полимиксина М. Разливают в чашки Петри. Среда имеет красно-коричневый цвет.

Для выделения многочисленной группы энтеробактерий после элективно-диагностических сред применяют дополнительные элективно-диагностические среды. Этими средами являются:

1. Среда Олькеницкого.

а) Соль Мора (0, 2 г) и гипосульфат предварительно растворяют в дистиллированной воде в пробирках. Отдельно растворяют три углевода (лактозы, сахароза, глюкоза по 1 г) и мочевину (10 г) в колбе на водяной бане.

б) Все ингредиенты добавляют к расплавленному агару, размешивают и фильтруют через стерильную марлю, устанавливают рН 7, 2-7, 4, вносят индикатор (фиолетовый красный - 0, 1 г, вода дистиллированная 25 мл), разливают в пробирки по 5-6 мл.

в) Стерилизуют при 0, 5 атм 20 мин, охлаждают в скошенном положении, для получения столбика высотой 2, 5 см и косяка - 4 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

2. Среда Ресселя.

Среда предложена для определения у микробов ферментов, расщепляющих лактозу и глюкозу, с применением индикатора Андреде. Среда содержит МПА, к которому добавлены 2 % лактозы и 1 % глюкозы и 2 % реактива Андреде. Среду стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 30 мин. Разливают по пробиркам и скашивают, чтобы столбик был снизу, а сверху – косяк. Посев в среду проводят уколом в столбик и затем штрихом по косяку. Расщепление микробами только глюкозы окрашивает столбик среды. При расщеплении лактозы краснеет весь столбик и косяк, потому, что ее больше. В случае газообразования появляются пузырьки газа или разрыв среды. Применяют среду для дополнительной дифференциации бактерий кишечной группы.

4. Среда Клиглера.

Среда коммерческая, производства НИИИВС им. Мечникова (г.Петрово-Дальнее).

Дифференциально-диагностические среды.

1. Среды Хисса:

К 1 % пептонной воде добавляют 0, 5 % раствор одного из углеводов (глюкоза, лактоза сорбит, маннит и пр.) и индикатор Андреде (кислый фуксин в 1 н растворе NaOH). Среды разливают по пробиркам, содержащим поплавки (трубка 3 см с одним запаянным концом) для улавливания газообразования при разложении углеводов. Стерилизацию проводят текучим паром. Среды бесцветны, рН 7, 2-7, 4. При сбраживании углевода среда должна приобретать красный цвет.

2. Среда с мочевиной Кристенсена.

К 100 мл дистиллированной воды добавить пептон 0, 1 г, хлорида натрия -0, 5 г, калия динитрофосфата - 0, 2 г, агара- 2 г, глюкозы- 0, 1 г, фенолового красного 0, 2 % - 0, 6 мл, 10 мл 20 % мочевины.

Пептон, соль, агар растворить при нагревании, установить рН 6, 8-6, 9, профильтровать, стерилизовать при 115⁰ С текучим паром 1 ч, охладить до 50⁰ С. Раствор мочевины асептично добавить к основе. Среду разлить в пробирки, охладить и скосить. При положительном результате среда становиться красной, при отрицательном результате на уреазу - остается желтой.

3. Среды для определения декарбоксилаз, лизина, аргинина, орнитина.

К 40 мл мясной воды добавить 0, 5 г пептона, глюкозы- 0, 1 г, дистиллированной воды - 60 мл, 1 мл 1, 6 % спиртового раствора бромтимолового синего, L-аминокислоты- 2 г или DL-аминокислоты, дрожжевого экстракта - 0, 3 г. В воде растворить белковую питательную основу и глюкозу. Установить рН 6, 0-6, 1. Разделить среду на 4 равных части. В каждую из трех порций внести одну из перечисленных аминокислот, четвертая порция - контроль.

Среды кипятят 5-10 мин, установить вновь рН 6, 0-6, 1, прибавить индикатор и разлить в пробирки по 2- мл. Стерилизовать при 0, 5 атм 15 мин. При расщеплении аминокислот цвет среды из желтой изменится в синий. В контроле - цвет желтый.

3. Среда Кларка.

а) Ингредиенты: пептон - 5, 0 г

глюкоза - 5, 0 г

калий фосфат двузамещенный - 5, 0 г

б) Растворяют все ингредиенты в небольшом количестве дистиллированной воды (80-100 мл) при подогревании на водяной бане в течение 29-30 мин. Затем их охлаждают до 20⁰ С, фильтруют, доводят дистиллированной водой до 1000 мл, разливают в пробирки по 5 мл. Стерилизуют дробно текучим паром три дня подряд.

в) К суточной культуре на среде Кларка добавляют равный объем 20 % раствора едкого калия. Встряхивают и помещают в термостат при 37⁰ С в наклонном положении. Учет проводят через 3-4 ч и на следующий день. При положительной реакции верхний слой жидкости окрашивается в оранжево-розовый цвет. При отрицательном результате - окраска остается неизменной. С помощью метода определяется наличие у микробов ацетилметилкар-бинола-ацетоина.

Существует очень много других сред относящихся к элективным, дифференциально- диагностическим и др., которые невозможно привести в данном разделе.

Бактериологический контроль питательных сред

Все серии питательных сред, изготавливаемые промышленным или лабораторным способами, необходимо контролировать по нескольким основным свойствам:

1. заданные цвет, консистенция, влажность, прозрачность,

2. ростовые свойства - скорость роста бактерий на среде, воспроизводимость, пышность роста и пр.

3. элективность - воспроизводимый рост необходимых бактерий, при исключении роста остальных,

4. ингибирование - воспроизводимое отсутствие роста посторонней микрофлоры.

Питательные среды должны давать рост бактерий (количество колоний, размер их, цвет и пр.), в соответствии с культуральными свойствами. Контроль питательных сред должен проводится с помощью тест-систем - типовых или местных штаммов бактерий. Исходная взвесь тест-культуры для контроля составляет 1 млрд бактерий в 1 мл.

Чувствительность сред определяется максимальным посевным разведением культур из исходной взвеси, которое дает максимальный рост бактерий на всех чашках. Скорость роста устанавливается по минимальному времени инкубации посевов в часах, в течение которого обеспечивается формирование четких видимых невооруженым глазом колоний бактерий.