Особенности постановки методов оценки хемотаксиса in vitroХотя метод довольно прост, необходимо остановиться на некоторых технических особенностях, способных существенным образом повлиять на миграционную активность и количество клеток, помещаемых в камеру. Так как хемотаксис связан с высокой метаболической активностью клеток, необходимо соблюдать определенный температурный режим. Максимальный хемотаксис наблюдается при 37 °С. В интервале тем- пературы от 33 до 43 °С значительных различий результатов миграции не наблюдается. Однако при экспериментальной гипотермии у свинок при температуре 29 °С отмечено снижение миграционной активности моноцитов. Состав среды, используемой при постановке метода, не требует каких-либо специальных добавок за исключением небольшого количества белка, облегчающего миграцию клеток. Наиболее оптимальный рН среды - 7, 0, хотя в некоторых случаях предпочтение отдается некоторому смещению рН в кислую сторону, что обычно характерно для воспалительной реакции in vivo. Как указывалось выше, моноциты, проходящие сквозь фильтры, могут попадать в раствор нижней камеры, и поэтому их не учитывают. Важное значение имеет время проведения реакции. При использовании поликарбонатных фильтров оптимальные сроки инкубации клеток при 37 °С - 90 мин. Следует избегать добавления в систему нативных сывороток. Например, сыворотка человека порой содержит факторы как способствующие хемотаксу, так и его ингибирующие. Важна также криоконсервация выделенных моноцитов. В отличие от всех других функций клеток хемотаксис у размороженных моноцитов снижен. Присутствие лимфоцитов в клеточной суспензии, загружаемой в камеру, обычно не влияет на хемотаксис моноцитов. При соблюдении стандартных условий постановки реакции техническая вариабельность результатов составляет около 20%, что вполне допустимо. Воспроизводимость метода весьма высокая. Рекомендуется подсчитывать при микроскопии как минимум 10 случайных полей миграции на 2 идентичных фильтрах. Если перед помещением на фильтры камеры моноциты были хорошо суспендированы, разбросы подсчета клеток в отдельных полях зрения под микроскопом невелики и связаны обычно только с ошибками при самом подсчете. В следующем разделе мы уделяем внимание ряду методических приемов оценки активности фагоцитарных клеток в генерации многочисленных медиаторных молекул (в первую очередь цитокинов и активных форм кислорода и азота). Все эти факторы врожденного иммунитета крайне важны для нормального функционирования иммунной системы, а особенно - для выявления патологических состояний, характеризующихся сниженной или повышенной выработкой подобных медиаторов.
|
