Визначення ліполітичної активності насіння

Матеріали і обладнання: 1) центрифуга на 15 тис. обертів; 2) пластмасові центрифужні пробірки з кришками на 10 мл: 3) термостат: 4) аналітичні терези; 5) бюретка для титрування на 10 мл: 6) колби на 50 мл; 7) пробірки: 8) ступки або випарювальні чашки; 9) цитрат-фосфатний буфер з рН 4, 6 (51, 8 мл 2, 87% розчини Nа₂НР0₄ і 48, 2 мл 2, 1% розчини лимонної кислоти (для льону олійного); 10) цитрат-фосфатний буфер з рН 4, 8 (50, 7 мл 2, 87% розчини Nа₂НР0₄ і 49, 3 мл 2, 1% розчини лимонної кислоти (для рицини); 11) 0.5 % розчин фенолфталеїну на 60% С₂Н₅0Н; 12) 0, 2% розчин NаОН для титрування; 13) насичений розчин NaCl, який містить 0, 05% тритон Х-100.

Для культур, які накопичують жири як запасний матеріал (льон, соняшник, рицина) дуже важливим показником є ліполітична активність насіння. Від цього показника залежить життя цих рослин на початкових етапах розвитку, коли рослина ще живиться гетеротрофно, за рахунок поживних речовин насіння.

Важливим моментом у визначенні ліполітичної активності є виділення ліпази у відносно чистому вигляді. Для цього її активують, створивши середовище з відповідною кислотністю. Для різних видів і навіть сортів вона різна, але знаходиться в діапазоні 4, 2 - 5, 2 рН. Активна ліпаза переходить безпосередньо в шар жиру, де починає розщеплювати його. Методом центрифугування відділяють шар жиру від водного. З шару жиру осаджують активну ліпазу насиченим розчином NаС1. Активність ліпази визначають титруванням 0, 2% розчином NаОН.

Хід аналізу

1. Екстракція кислої ліпази насіння

Наважку (5 г) подрібненого насіння розтирають з невеликою кількістю цитрат-фосфатного буферу до гомогенного кашоподібного стану. Потім цю суміш поміщають в центрифужні пробірки і центрифугуют при 15 тис. об/хв. 15 хвилин.

Після центрифугування суміш розділяється на три шари: верхній - жировий, який містить слиз, жир та ліпазу; середній - водний, який містить водорозчинні речовини; нижній - осад.

Для виділення кислої ліпази беруть верхній жировий шар, додають до нього насичений розчин NaCl, який містить 0, 05% тритон Х-100, щоб розділити слиз, жир та ліпазу (1: 1 за об'ємом), збовтують суміш і центрифугують 15 хв. при 13 тис. об/хв. Утворюються 4 шари: верхній, який містить слиз; жировий шар, який містить олію; водний і осад (ліпаза). Для аналізу потрібен тільки жировий шар і осад ліпази, який розчиняють в 0, 5мл буферу.

2. Визначення ліполітичної активності

В дві пробірки поміщають по 0, 5 мл цитрат-фосфатного буфера, по 0, 5 мл розчину ліпази і по 3 краплі олії, яка була взята з жирового шару. Одну з цих пробірок поміщають на інкубацію в заздалегідь нагрітий до 37°С термостат на 1 годину (дослід). До іншої пробірки (контроль) додають 2 краплі 0, 5% розчину фенолфталеїну (розчин при цьому каламутніє) і титрують 0, 2% розчином NаОН до появи стійкого блідо-рожевого забарвлення.

Після інкубації титрується і дослідна проба. За різницею між витраченим на титрування досліду і контролю NаОН розраховується ліполітична активність (мл\год).

Завдання: визначити ліполітичну активність даного насіння.

Контрольні питання

I. Виконати тестові завдання:

1) Білки – це структуроутворюючий та функціонально активний матеріал протопласта. На якому рівні структури проявляються функціональна специфічність і біологічна активність білкових молекул?

a) на рівні первинного поліпептидного ланцюга;

b) на рівні вторинної структури;

c) на рівні третинної і четвертинної структур.

2) Яка фракція білків розчинна у розчинах солей?

a) альбуміни;

b) глобуліни;

c) проламіни;

d) глютеліни.

3) Гідроліз крохмалю при проростанні насіння злаків здійснюється ферментом:

a) пепсином;

b) амілазою;

c) пероксидазою;

d) карбоксилазою

4) Які органели беруть участь у процесі використання жирів як енергетичного субстрату?

a) мітохондрії;

b) гліоксісоми;

c) пероксісоми;

d) хлоропласти.

5) Рослинні жири на відміну від тваринних обов‘язково містять:

a) насичені жирні кислоти;

b) ненасичені жирні кислоти;

c) входять до складу мембран.

 

II. Відповісти на питання:

1. Як провести визначення ізоелектричної точки рослинних тканин?
2. Як провести визначення кислотного гідролізу крохмалю?
3. Як провести виділення запасних білків рослин та виявити їх основні властивості?
4. Як провести визначення ферментативного гідролізу крохмалю?